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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何利用基因组DNA进行real time PCR ？？？？
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ada800515

新虫 (初入文坛)

[求助] 如何利用基因组DNA进行real time PCR ？？？？

求助利用基因组DNA进行real-time PCR的相关问题。急急急急急！！！
我先介绍下试验设计：最近想要进行一个实验，是对基因组DNA进行葡萄糖基化修饰，然后利用内切酶进行酶切，在酶切位点的两端设计引物，并进行real-time PCR。如果内切酶识别的酶切位点被修饰了，则切不断；反之，没被修饰的能够切断。这样在酶切位点两端设计引物，进行real-time PCR，如果有扩增的片段，就证明酶切位点被修饰了，因为修饰的位点不能被切断；反之，没有扩增片段就证明这个位点没有被修饰。real-time PCR的结果就能体现修饰后，基因组DNA上酶切位点的修饰程度。
我现在有几个问题：
1.之前都是用mRNA进行逆转录PCR，然后用cDNA做模板进行real-time PCR，为了看基因的表达，这类real-time PCR可以选用GAPDH或者18S做内参。没做过用基因组DNA做模板进行real-time PCR。如果用基因组DNA做模板进行real-time PCR的话，应该选用什么做内参？
2.如果用相对定量法进行实验组与对照组之间的比较，可以用2-△△CT法吗？
3.如果不能用2-△△CT法，用什么方法检测实验组与对照组的差别。
还望各位，不吝赐教。
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1楼 2013-01-10 16:27:55
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-01-10 20:28:21
ada800515: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-01-14 09:57:25
以前做过SNP位点的RFLP，和你的设计差不多，不过只要PCR--酶切--电泳,就可以看到结果
你的设计是基因组--处理--酶切--Realtime PCR，是这个意思么？
如果酶切之后可以电泳看到条带差别也就别做定量PCR了，多说明不了什么问题
我觉得如果要做的话，开始试验时设计一个管家基因比如GAPDH和一个你这个基因的其他片断做对照就行了
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2楼2013-01-10 17:52:50
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普通回帖

ccharlien

木虫 (正式写手)
抱歉，刚才忘记了是基因组，酶切看不出差别，修改不了，在这说明一下
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3楼2013-01-10 17:57:32
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ada800515

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-10 17:57:32
抱歉，刚才忘记了是基因组，酶切看不出差别，修改不了，在这说明一下

您好，请问为什么基因组DNA酶切看不出差别？我其实不是想看酶切后PCR产物的“有”或者“无"，我是想看不同刺激下样品间的差异。由于基因组是多个细胞的基因组的混合，real time PCR 后从中可以看到量上的差别吧，这不就体现了不同刺激下，样品之间的差别了吗？我以前有做普通PCR，但是看不出量上的差别，所以想用更加灵敏的real time PCR
您提到的设计GAPDH做对照，是不是设计GAPDH基因组DNA的引物，然后以此作为内参，像做RT-qPCR那样，用2-△△CT法计算呢？还是需要做绝对定量吗？
还望继续指导。
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4楼2013-01-11 10:18:48
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ccharlien

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ada800515 at 2013-01-11 10:18:48
您好，请问为什么基因组DNA酶切看不出差别？我其实不是想看酶切后PCR产物的“有”或者“无"，我是想看不同刺激下样品间的差异。由于基因组是多个细胞的基因组的混合，real time PCR 后从中可以看到量上的差别 ...

指导谈不上，大家讨论而已。基因组就是一团乱，你的基因占基因组的比重很小，即使都切开了也看不出差别。
如果你的处理达到目的，做Realtime应该是能看到差异的。相对定量可以，我觉得可以用GAPDH做内参，然后一对你酶切位点两端的引物，一对同一个基因其他部分的引物，证明基因的量没变是修饰的差别。
如果你普通PCR看不出量上的差别，可以减少循环数看看，也要考虑是不是酶切效率不足，摸索一下酶量和时间的优化，确保酶切把大部分没有修饰的位点都切开了
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5楼2013-01-11 17:49:41
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