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danyzj01

银虫 (正式写手)

[求助] 提基因组的时候做第一次PCR效果很好，但是直接以PCR产物做第二次PCR的模版后...

直接以PCR产物做第二次PCR的模版后，引物二聚体增加很多，也有目的条带出来，另外PCR体系的组分未变
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1楼 2012-05-02 22:10:50
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

fwks3518

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-03 13:59:09
关于二次PCR效果极差的问题，之前版块里有过很多讨论，我也曾困惑于二次PCR的结果。所以一般不鼓励二次pCR，如果需要的产物比较多，就第一次扩增的时候多扩增一些。如果非要二次PCR，建议使用巢式PCR，效果会好一些，也比较麻烦一些。
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6楼2012-05-03 09:17:10
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-03 13:59:20
danyzj01: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-05-25 22:26:15
这个现象也挺正常的，一是第一次pcr的产物如果用作模板的话最好是回收了之后用，或者是稀释了之后用，二是，二次pcr的时候，引物的结合肯定会受到影响吧，因为在旁边都没有碱基了，直接从头上结合，可能会影响效率
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7楼2012-05-03 10:38:17
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wuge415

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-03 13:59:30
通常，直接以上次pcr产物为模版，一般需稀释10-100倍，以避免过度的模版以及上次pcr中的引物及引物二聚体等等；条件许可，最好用回收试剂盒，有利于条件优化及后续实验
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8楼2012-05-03 13:45:00
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nemo88

禁虫 (小有名气)
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-04 13:47:29
本帖内容被屏蔽
9楼2012-05-04 07:49:58
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bbwalkman

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-04 13:47:40
我做的时候都是把第一次PCR产物进行稀释呢，然后再P基本上都是目的条带，你把你的产物稀释一下再P，然后看看效果怎么样，如果还不行那是不是引物或者温度选择的不合适，检查一下。
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10楼2012-05-04 09:24:12
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普通回帖

张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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你回收的PCR产物再做模板加的量是不是太多了？
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未来不是梦
2楼2012-05-02 22:23:10
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danyzj01

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-02 22:23:10:
你回收的PCR产物再做模板加的量是不是太多了？

模版量多还是别的东西多？
是直接以PCR产物做模版，不是回收琼脂糖胶上的PCR产物
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3楼2012-05-02 22:36:05
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vir2008

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR产物一般都要稀释的，太浓了反而不容易做好。
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4楼2012-05-02 23:25:40
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
。这种情况正常，只要你的目的条带够亮就行，引物二聚体的形成不是每次都有，每次都亮的，有的时候就出来了，我们也说不清楚为什么。
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5楼2012-05-03 08:43:11
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