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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR效果问题
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR效果问题 已有6人参与

小虫最近用昆虫COII的通用引物对一批一个样本进行了扩增（基因组之前用cytb、COI通用引物分别进行了扩增，效果不错），25ul体系：10*buffer2.5ul，2.5mMdNTP2ul，10UM引物各0.5ul，taq酶1U，模板与之前扩cytb等一致，0.5ul；
退火温度分别采用了46-52度梯度，另外还采用了文献方法，先46度退火6个循环，再52度30循环（不知道是什么原理），结果电泳效果大家都一致，均为较弱的涂抹带。大家能帮忙分析分析可能是哪方面的问题吗？有没有可能得到改进呢

图片右起依次为DL2000marker，空白，46、48、50、52退火及两步退火产物
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1楼 2010-12-08 21:36:41
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
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2楼2010-12-10 12:59:38
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nkk12345

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
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3楼2010-12-10 14:43:53
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
找个确定的做对照 ，以排除试剂的问题
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4楼2010-12-10 18:17:36
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)
内容已删除
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5楼2010-12-10 21:27:52
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yixuanwin at 2010-12-10 18:17:36:
找个确定的做对照 ，以排除试剂的问题

试剂的问题似乎不大。您指的对照不一定是用这对引物吧。
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6楼2010-12-10 21:29:28
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):good 2010-12-11 08:41:54
依据我的感觉，你这个扩增不是PCR反应的问题，是引物问题，引物的Tm是多少？会不会比52度高很多，如果不会高很多，劝你放弃这个引物吧。另外还有一种可能就是之前很好的DNA，现在降解了，但是这种可能很小，还是应该考虑引物问题
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7楼2010-12-10 21:41:20
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-12-10 21:41:20:
依据我的感觉，你这个扩增不是PCR反应的问题，是引物问题，引物的Tm是多少？会不会比52度高很多，如果不会高很多，劝你放弃这个引物吧。另外还有一种可能就是之前很好的DNA，现在降解了，但是这种可能很小，还是应 ...

我是用的文献上的引物序列
EVA：GAGACCATTACTTGCTTTCAGTCACT
PATRICK：CTAATATGGCAGATTATATGTATTGG
似乎是比52度高很多，那您的意思是提高退火温度试试？
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8楼2010-12-10 21:52:33
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tryingtimes

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
图片的焦距就是你扫描后，查看图片时候放大缩小的问题吧，你别把图片放太大就行了~
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没完没了
9楼2010-12-10 23:13:45
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-12-10 21:41:20:
依据我的感觉，你这个扩增不是PCR反应的问题，是引物问题，引物的Tm是多少？会不会比52度高很多，如果不会高很多，劝你放弃这个引物吧。另外还有一种可能就是之前很好的DNA，现在降解了，但是这种可能很小，还是应 ...

您的判断非常精准呢我又提高温度跑了梯度，还是涂抹带，同时用了另一对引物，那对引物出了亮带
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10楼2010-12-13 20:05:25
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