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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于qPCR的几个问题，求解答
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MiFly

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于qPCR的几个问题，求解答

1、用2-ΔΔCt法时，目的基因与内参的扩增效率必须完全一样么？相差多少是可以接受的？如果差别在允许的范围内，要修正公式2-ΔΔCt时，应该用哪一个扩增效率来替换公式中的“2”，或者用算数均值？
2、我做标曲的时候，一个基因的扩增效率一直高于110%，溶解曲线是单峰，电泳也没有杂带，应该不是引物的问题吧，请问要怎么优化反应才能降低扩增效率？
3、内参和目的基因用的是不同机器不同反应体系不同的反应程序，影响后面的结果分析么？

先谢过！
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1楼 2012-06-07 21:38:53
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回帖置顶 ( 共有2个 )

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 很久没来啊，好像。辛苦了 2012-06-08 14:01:33
MiFly: 金币+4, ★★★很有帮助, 多谢指点，受教了！ 2012-06-08 17:35:48
嗯...................
       偶应召唤而来

       1. 肯定是需要近似一样的扩增效率 相差10%（我记得是这个数字）之内是可以接受的 但是需要注意 内参和你目的基因扩增效率必须均接近100% 不能说我内参和目的基因相近但都是80%或120% 这肯定是不能用2-ΔΔCt法的 毕竟那个2的意义摆在那里呢 具体你要用什么来代替2 那不是这样用的 那就不是涉及到用2-ΔΔCt法 而是有些改进方法（具体我最近研究中 但还是未参透 一直用那些改进法 自己数学太差 理解起来很费事）
       2. 扩增效率高低出一定数值 我觉的均是与引物有关 那跟扩增特异性应该是关系不大的（你说的单峰 单带）可能模板问题或设计问题导致上下引物的配合有差异（我自己的理解 就是指上引物结合到一定程度了 你下引物还没有结合到我这种程度）所以多设计几条引物试试吧 并非说没有任何错配 Hairpin Dimer 就万事大吉了.....
       3. 当然影响了 没有说把内参和目的分开P的吧 还是你这种不同机器 不同实验条件 你太小看定量的敏感性了 就是做RT-PCR的都有要求内参调好后再与目的一起P一次滴..............
       个人看法 若有说错请高手指点
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Let God do with it as He wills
3楼2012-06-07 23:20:30
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 专家当然更辛苦了 2012-06-08 14:02:08
MiFly: 金币+1, ★★★很有帮助, 辛苦了，十分感谢！ 2012-06-08 17:37:01
我来晚了，下面的专家也解答的差不多了。
1.其实这个2，更准确的来说是1+X，X代表扩增效率，这个公式应用的前提就是扩增效率达到90%-120%，且内参和目的基因扩增效率相近。我这里说的120%有点大，但在实际的某些实验中，是可以接受的。如果你实在没设计好引物使其达到要求，建议你使用一个好像叫做扩增效率计算工具的软件，他可以帮你计算、转化。
2.扩增效率偏大的主要原因是自己在稀释时候的操作与体系中的抑制剂原因。为了进一步确定，你可以看下楼下专家写的一篇文章叫做 about qPCR,她里面提到了几个对照，你可以做下，帮助你寻找原因。我个人认为你完全可以不用担心，因为110%实际上是可以接受的
3.最好别这样干，肯定有影响。这就好比你用不同的天平称量东西，虽都是天平，但称出的结果肯定有差异，何况是qPCR这么敏感的仪器呢？
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4楼2012-06-08 10:00:30
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普通回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
帮顶~@孙启亮  @atlanticwi
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2楼2012-06-07 22:53:55
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