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7788945

银虫 (小有名气)

[交流] 帮我看看这个溶解qPCR曲线

做了几组定量，得到了如下的溶解曲线。
其中“问题青年”是让我上火的图，“对照1”用的同“问题青年”一样的引物，“对照2”用的同“问题青年”一样的模板

对照1



对照2



问题青年

[ Last edited by 1949stone on 2011-10-31 at 21:52 ]
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1楼 2011-10-31 17:09:47
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云霆子

金虫 (小有名气)
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7788945(金币+1): 2011-10-31 20:15:56
你有没有把你qPCR的产物跑个电泳？我怀疑“问题青年”有非特异扩增，而且扩增效率不高，引物和模板是不是不匹配？
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2楼2011-10-31 18:42:10
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7788945

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 云霆子 at 2011-10-31 18:42:10:
你有没有把你qPCR的产物跑个电泳？我怀疑“问题青年”有非特异扩增，而且扩增效率不高，引物和模板是不是不匹配？

跑了一下，的确有非特异性扩增，这个引物和模板之前是做过好几次的，跑普通的PCR，只是有二聚体而已，但是这个定量跑完了竟然出了涂抹带
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3楼2011-10-31 19:59:20
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云霆子

金虫 (小有名气)
★
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7788945(金币+1): 2011-10-31 22:15:07
引用回帖:
3楼: Originally posted by 7788945 at 2011-10-31 19:59:20:
跑了一下，的确有非特异性扩增，这个引物和模板之前是做过好几次的，跑普通的PCR，只是有二聚体而已，但是这个定量跑完了竟然出了涂抹带

那你做普通的PCR与qPCR用的条件相同么？比如退火温度。
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4楼2011-10-31 20:19:02
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cloverplm

金虫 (小有名气)
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1949stone(金币+2): 问题青年 咋有文艺青年的范儿啊 2011-10-31 21:53:07
7788945(金币+1): 2011-10-31 22:15:10
从图上看，“问题青年”有非特异性扩增，溶解曲线的峰图太杂，可不可以用循环数为横坐标作个图，看这几个图形的峰值起峰点是否一致，“问题青年”的实验可以多做几次比较下。
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5楼2011-10-31 20:29:24
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7788945

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 云霆子 at 2011-10-31 20:19:02:
那你做普通的PCR与qPCR用的条件相同么？比如退火温度。

相同，cDNA模板200ng，59°退火，40cycles，不同的大概只有酶不一样了，定量试剂里是热启动酶，我觉得这些没什么问题，主要困惑在于其他反应里没有问题的模板和引物到了这里却出了很多杂带。不会是模板降解吧，刚刚提的RNA和刚反转的模板，应该没有这个问题，反转后是用内参试的，有条带，刚才又做了一次，模板加到了400ng，没有带
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6楼2011-10-31 22:06:29
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7788945

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cloverplm at 2011-10-31 20:29:24:
从图上看，“问题青年”有非特异性扩增，溶解曲线的峰图太杂，可不可以用循环数为横坐标作个图，看这几个图形的峰值起峰点是否一致，“问题青年”的实验可以多做几次比较下。

起峰点不一样，“问题青年”起峰很晚，到了30cycles以后才起峰，做了40cycles，反应完的时候还没到平台期呢，所以重做是必须的了，两个对照一个是20左右，另一个是25左右
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7楼2011-10-31 22:21:43
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