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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 帮我看看这个溶解qPCR曲线
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7788945

银虫 (小有名气)

[交流] 帮我看看这个溶解qPCR曲线

做了几组定量，得到了如下的溶解曲线。
其中“问题青年”是让我上火的图，“对照1”用的同“问题青年”一样的引物，“对照2”用的同“问题青年”一样的模板

对照1



对照2



问题青年

[ Last edited by 1949stone on 2011-10-31 at 21:52 ]
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1楼 2011-10-31 17:09:47
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7788945

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 云霆子 at 2011-10-31 20:19:02:
那你做普通的PCR与qPCR用的条件相同么？比如退火温度。

相同，cDNA模板200ng，59°退火，40cycles，不同的大概只有酶不一样了，定量试剂里是热启动酶，我觉得这些没什么问题，主要困惑在于其他反应里没有问题的模板和引物到了这里却出了很多杂带。不会是模板降解吧，刚刚提的RNA和刚反转的模板，应该没有这个问题，反转后是用内参试的，有条带，刚才又做了一次，模板加到了400ng，没有带
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6楼2011-10-31 22:06:29
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云霆子

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
7788945(金币+1): 2011-10-31 20:15:56
你有没有把你qPCR的产物跑个电泳？我怀疑“问题青年”有非特异扩增，而且扩增效率不高，引物和模板是不是不匹配？
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2楼2011-10-31 18:42:10
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7788945

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 云霆子 at 2011-10-31 18:42:10:
你有没有把你qPCR的产物跑个电泳？我怀疑“问题青年”有非特异扩增，而且扩增效率不高，引物和模板是不是不匹配？

跑了一下，的确有非特异性扩增，这个引物和模板之前是做过好几次的，跑普通的PCR，只是有二聚体而已，但是这个定量跑完了竟然出了涂抹带
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3楼2011-10-31 19:59:20
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云霆子

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
7788945(金币+1): 2011-10-31 22:15:07
引用回帖:
3楼: Originally posted by 7788945 at 2011-10-31 19:59:20:
跑了一下，的确有非特异性扩增，这个引物和模板之前是做过好几次的，跑普通的PCR，只是有二聚体而已，但是这个定量跑完了竟然出了涂抹带

那你做普通的PCR与qPCR用的条件相同么？比如退火温度。
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4楼2011-10-31 20:19:02
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