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shiliyusly

新虫 (小有名气)

[求助] QPCR之 扩增效率

大家好！之前在坛里发过帖子对于QPCR学到很多，现在总结就是扩增效率很重要。
一直有2个问题基因在折磨着我，目前我还没到绝望到换引物的地步，所以还是想先摸下优化条件，因为我引物设计也不熟练，实在是没有把握能设计个新的好的。
一个是内标基因ACT，普通PCR摸的退火温度是47度，QPCR上做了47度，60度，65度并且引物减半的，图如下：
现在想请教下高手ACT接下去该怎么摸呢？
另一个基因是F3'H,溶解曲线有个小峰，空白对照都有小峰，并且峰型和样品的差不多，两个峰。
之前60度二步法扩增效率80%，后来我用52度三步法扩增效率达到98%，线性拟合度达0.99多，想问这样是不是OK呢，顾虑就是溶解曲线有小峰，但是空白对照就是有小峰的，空白和最低稀释度的峰型基本一样。有点奇怪。F3'H溶解曲线如下第2个图：
还麻烦高手指点下啊，谢谢谢谢！！！

3个ACT比较图.jpg



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1楼2013-01-26 21:50:43
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+3, ★有帮助 2013-01-28 10:05:52
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-01-29 08:30:42
从F3'H扩增来看，小峰多半是引物二聚体。你说的空白对照峰型和样品差不多是什么意思？你指空白对照也能有扩增吗？空白对照出现标准峰的话一般是指样品有基因组DNA污染。如果我没记错，你做的是杨梅？你引物设计的时候是否跨越了内含子？如果有跨内含子，基因组DNA扩增出来的峰与cDNA的峰应该是不同的。空白对照往往容易出现熔解温度较低的峰，那是引物二聚体造成的，因为缺少特异扩增，引物二聚体形成会比样品更严重一些。你的这个情况，只能说引物不好。
有一点要说明的是，目标基因和内参基因扩增时的退火温度最好选取一致。因为做定量时需要它们在同样的条件下扩增。为什么要这么做你大概也是知道的。荧光强度随着温度升高是衰减的，这个可以从熔解曲线上看。曲线一直是下降的，当熔解产物时，有很陡的slop出现。所以，做很多基因定量时，引物设计方面除了要考虑特异性和高阶结构以外，还要考虑退火温度大致相同。
从内参的三个图来看，内参的引物的问题似乎更大。退火温度高时CT数大是正常趋势，但是图上熔解温度高于80°C的有两个峰。退火温度越低，前面的峰越大。这个说明很可能引物有非特异扩增。如果你的内标出现这种问题，我看换引物是最佳选择。
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2楼2013-01-27 03:38:38
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-27 03:38:38
从F3'H扩增来看，小峰多半是引物二聚体。你说的空白对照峰型和样品差不多是什么意思？你指空白对照也能有扩增吗？空白对照出现标准峰的话一般是指样品有基因组DNA污染。如果我没记错，你做的是杨梅？你引物设计的时 ...

亲，谢谢你！
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3楼2013-01-28 09:53:33
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-27 03:38:38
从F3'H扩增来看，小峰多半是引物二聚体。你说的空白对照峰型和样品差不多是什么意思？你指空白对照也能有扩增吗？空白对照出现标准峰的话一般是指样品有基因组DNA污染。如果我没记错，你做的是杨梅？你引物设计的时 ...

F3'H的引物我也不知道有没有跨内含子，直接拿人家SCI收录文章里的引物。空白的峰和样品的峰差不多，的确是这样有小峰的引物明显不是很好的，但是它的扩增效率已经达到要求了，是不是可以用呢？另外正常空白应该是怎么样的呢？
ACT我还想试下用63或65度做下扩增效率，想说这样会不会把非特异性扩增降到最小到没有呢？
这样感觉我挺拗的，一直强调要换引物就是不换，主要是因为这样的时间点怕引物快递过来有点慢还有就是我对自己设计引物实在没有信心。。。
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4楼2013-01-28 10:05:41
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-01-29 08:31:00
shiliyusly: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-01-29 09:56:03
引用回帖:
4楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-01-28 10:05:41
F3'H的引物我也不知道有没有跨内含子，直接拿人家SCI收录文章里的引物。空白的峰和样品的峰差不多，的确是这样有小峰的引物明显不是很好的，但是它的扩增效率已经达到要求了，是不是可以用呢？另外正常空白应该是怎 ...

正常的空白应该没有扩增，什么都没有，读不到CT，扩增曲线是在baseline。当然，这是非常理想的情况，有时候是可以看到空白的扩增曲线稍微有些抬头的，但整个荧光水平非常低，未到达检测限。
是否该用F3'H引物你只有自己决定了。反正不是理想的引物。对于ACT，你想摸条件也是可以的。但我觉得吧，你应该在摸条件的同时也订一下新的引物。
引物合成一般不是很慢吧，你对自己设计引物信心不足这个我可以理解。谁都有这个阶段。尤其是做定量的引物，不是能P出来就一定好用的。一般是这样的，反正引物也不贵，可以对一个基因设计两三对引物，选效果好的一对做实验。
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5楼2013-01-29 01:14:58
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-29 01:14:58
正常的空白应该没有扩增，什么都没有，读不到CT，扩增曲线是在baseline。当然，这是非常理想的情况，有时候是可以看到空白的扩增曲线稍微有些抬头的，但整个荧光水平非常低，未到达检测限。
是否该用F3'H引物你只 ...

昨天摸了下ACT的还是不怎么好，看样子真的得换引物了。
您可以跟我讲下在你看来设计定量引物要点是哪些吗？之前网上也看了一些，有些罗列的比较少，有些就很多了，当然肯定是满足越多越好，但是这是不实际的，很难满足那么多。
另外问个有的没的，您觉得stratagene和bio-rad比，哪个更好些？
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6楼2013-01-29 09:55:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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6楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-01-29 09:55:55
昨天摸了下ACT的还是不怎么好，看样子真的得换引物了。
您可以跟我讲下在你看来设计定量引物要点是哪些吗？之前网上也看了一些，有些罗列的比较少，有些就很多了，当然肯定是满足越多越好，但是这是不实际的，很难 ...

引物设计首先是确定你想要做的退火温度，这样大致决定多少碱基数目。然后决定你要扩增片段的大小，一般定量不要用很大的片段，150bp-500bp。如果你已经有不少引物了，这次合成的引物要和那些引物的差不多。然后就是引物序列了。有引物设计软件帮助。主要是考虑引物的特异性和二级结构问题。这个你也很明白的，特异性就是不要扩出其他基因来。引物不要形成稳定的二级结构，引物自身及与互补引物之间的相连碱基配对是越少越好的。你做的是真核生物的，一般是从CDS上设计，最好能跨内含子。实在不好办不跨也可以。实在不行，也可以用非翻译区的序列。考虑诸多因素后，往往是在一些引物里面挑1-2对。
这两个公司都不错吧，我个人比较喜欢用bio-rad的东西。
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shiliyusly
7楼2013-01-30 08:53:11
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
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7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-30 08:53:11
引物设计首先是确定你想要做的退火温度，这样大致决定多少碱基数目。然后决定你要扩增片段的大小，一般定量不要用很大的片段，150bp-500bp。如果你已经有不少引物了，这次合成的引物要和那些引物的差不多。然后就是 ...

嘿嘿，感谢感谢，受益匪浅！
对了，另外再问个问题哦，我要做未知序列的QPCR，我是设计简并引物PCR后就可以直接测序吧？不需要载体克隆后菌液拿去测序吧？
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8楼2013-01-30 09:33:35
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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8楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-01-30 09:33:35
嘿嘿，感谢感谢，受益匪浅！
对了，另外再问个问题哦，我要做未知序列的QPCR，我是设计简并引物PCR后就可以直接测序吧？不需要载体克隆后菌液拿去测序吧？...

可以直接测序。测序的结果没问题的话不需要做克隆。不过有时候PCR产物不单一，直接测序出现双峰什么的问题。
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9楼2013-01-30 11:06:21
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