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shiliyusly新虫 (小有名气)
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QPCR之 扩增效率
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大家好！之前在坛里发过帖子对于QPCR学到很多，现在总结就是扩增效率很重要。 一直有2个问题基因在折磨着我，目前我还没到绝望到换引物的地步，所以还是想先摸下优化条件，因为我引物设计也不熟练，实在是没有把握能设计个新的好的。 一个是内标基因ACT，普通PCR摸的退火温度是47度，QPCR上做了47度，60度，65度并且引物减半的，图如下： 现在想请教下高手ACT接下去该怎么摸呢？ 另一个基因是F3'H,溶解曲线有个小峰，空白对照都有小峰，并且峰型和样品的差不多，两个峰。 之前60度二步法扩增效率80%，后来我用52度三步法扩增效率达到98%，线性拟合度达0.99多，想问这样是不是OK呢，顾虑就是溶解曲线有小峰，但是空白对照就是有小峰的，空白和最低稀释度的峰型基本一样。有点奇怪。F3'H溶解曲线如下第2个图： 还麻烦高手指点下啊，谢谢谢谢！！！  3个ACT比较图.jpg  2Z75(V$JY09JG]IP%`PLWZE.jpg |
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 QPCR 问题简答 |
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从F3'H扩增来看，小峰多半是引物二聚体。你说的空白对照峰型和样品差不多是什么意思？你指空白对照也能有扩增吗？空白对照出现标准峰的话一般是指样品有基因组DNA污染。如果我没记错，你做的是杨梅？你引物设计的时候是否跨越了内含子？如果有跨内含子，基因组DNA扩增出来的峰与cDNA的峰应该是不同的。空白对照往往容易出现熔解温度较低的峰，那是引物二聚体造成的，因为缺少特异扩增，引物二聚体形成会比样品更严重一些。你的这个情况，只能说引物不好。 有一点要说明的是，目标基因和内参基因扩增时的退火温度最好选取一致。因为做定量时需要它们在同样的条件下扩增。为什么要这么做你大概也是知道的。荧光强度随着温度升高是衰减的，这个可以从熔解曲线上看。曲线一直是下降的，当熔解产物时，有很陡的slop出现。所以，做很多基因定量时，引物设计方面除了要考虑特异性和高阶结构以外，还要考虑退火温度大致相同。 从内参的三个图来看，内参的引物的问题似乎更大。退火温度高时CT数大是正常趋势，但是图上熔解温度高于80°C的有两个峰。退火温度越低，前面的峰越大。这个说明很可能引物有非特异扩增。如果你的内标出现这种问题，我看换引物是最佳选择。 |
2楼2013-01-27 03:38:38
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正常的空白应该没有扩增，什么都没有，读不到CT，扩增曲线是在baseline。当然，这是非常理想的情况，有时候是可以看到空白的扩增曲线稍微有些抬头的，但整个荧光水平非常低，未到达检测限。 是否该用F3'H引物你只有自己决定了。反正不是理想的引物。对于ACT，你想摸条件也是可以的。但我觉得吧，你应该在摸条件的同时也订一下新的引物。 引物合成一般不是很慢吧，你对自己设计引物信心不足这个我可以理解。谁都有这个阶段。尤其是做定量的引物，不是能P出来就一定好用的。一般是这样的，反正引物也不贵，可以对一个基因设计两三对引物，选效果好的一对做实验。 |
5楼2013-01-29 01:14:58
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引物设计首先是确定你想要做的退火温度，这样大致决定多少碱基数目。然后决定你要扩增片段的大小，一般定量不要用很大的片段，150bp-500bp。如果你已经有不少引物了，这次合成的引物要和那些引物的差不多。然后就是引物序列了。有引物设计软件帮助。主要是考虑引物的特异性和二级结构问题。这个你也很明白的，特异性就是不要扩出其他基因来。引物不要形成稳定的二级结构，引物自身及与互补引物之间的相连碱基配对是越少越好的。你做的是真核生物的，一般是从CDS上设计，最好能跨内含子。实在不好办不跨也可以。实在不行，也可以用非翻译区的序列。考虑诸多因素后，往往是在一些引物里面挑1-2对。 这两个公司都不错吧，我个人比较喜欢用bio-rad的东西。 |
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shiliyusly7楼2013-01-30 08:53:11
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