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莎姑子

银虫 (初入文坛)

[求助] Real-Time PCR加样过程中的那些细节

急求各位高手哥哥姐姐帮忙啊
做实时荧光定量PCR，做扩增效率的曲线R2如何才能达到0.99以上，加样过程中有哪些细节需要注意的，使用枪的过程中又有哪些需要注意的，各位高手指点下吧，每次做出来的曲线基本都不好，愁死我了啊
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real time-pcr QPCR 问题简答

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1楼 2012-04-11 11:29:56
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回帖置顶 ( 共有1个 )

莎姑子

银虫 (初入文坛)
莎姑子: 回帖置顶 2012-04-11 19:00:05
各位大哥大姐们啊，给点指点吧
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10楼2012-04-11 18:57:45
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 热心又专业，欢迎常来本版，建议做专家顾问吧 2012-04-11 13:57:15
莎姑子: 金币+2, ★有帮助 2012-04-11 15:27:03
嗯.............
偶来了
1. 加样枪最好专用，并定期矫正，能使用吉尔森某款具有锁定功能的枪最好，eppendorf的reserch系列好像基本都没有锁定量程功能
2. 技术误差大，有一部分也是你没有混合好PCR成分的原因，所有PCR成分在用前必须尽量涡旋完全（不过也有报道指出涡旋对酶不好，所以要是担心这点，请颠倒混匀20X以上以达到充分效果）
3. 模板和Mix混合时，尽量选择稀释过的模板，不要取0.5ul以下体积的模板，稍微枪头上带点的话，就能引起误差，如果非要选择吸取0.5ul以下的模板，请采用倒置吸量法，即二档吸取一档打。混合时强烈涡旋1min以上
4. 加样请使用优质硅化枪头，绝对要一次打干净液体，若用96孔板，倾斜一定角度贴壁缓慢（不是很慢的那种）加比较有效果，若用8连管，枪头贴壁倾斜角度反而不能过大，同时注意不要加到盖子能碰到的地方
以上个人经验 若有说错希望高手指正哦
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Let God do with it as He wills
2楼2012-04-11 11:45:29
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 专家考核, 哪有，很专业的说 2012-04-11 13:57:57
一楼专家解释的已经很完整了。人家很专业，咱没法比，但是我的小经验还是送给你吧。感觉你的问题不是出在污染这一块，而是稀释的时候没做好，导致Ct值变化不呈现一定的规律性。由于八排连管容量小，加之你的体系少，这样就产生一个问题，就是你在稀释的时候液体由于受管底表面张力和静电的作用而不能很好的流动，这就是导致稀释不好的真正原因。这种缺陷对低拷贝基因的影响尤其大。解决方法是稀释的时候推干净模板的时候赶紧换枪头，因为枪头外围也会粘连上一个浓度梯度的模板，不换会产生很大影响。稀释的时候不要用枪头反复吹打，几次就可以了。然后轻微的涡旋一下，因为剧烈的涡旋可能会对体系产生影响。最后实在不行的话，换荧光，多尝试一下
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3楼2012-04-11 13:08:48
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★ ★
西瓜: 金币+2, Good 2012-04-11 21:59:55
引用回帖:
8楼: Originally posted by 蓝慧 at 2012-04-11 18:44:56:
请问二档吸取一档打是什么意思？最近也在做定量，不是很懂

.......................
不是我的帖子你们不引用我的话 我是看不到的 好在闲逛回来咯

移液器本身有四种用法，当然其他两种我们也用不到，经常用到的两种其一是我们正常移液法，一档吸取，二档打空。第二种则专门针对移去极微量液体（但在移液器量程内，通常指2.5ul移液器的0.1~0.5ul范围内）或粘稠易挥发液体，将正常使用的移液方法倒过来用就可了，二档吸取，一档打空。虽然会浪费一些，但是对极微量模板的加样是有好处的，有兴趣可以尝试下，但当加样量超过0.5ul时，这样做就没有什么必要了
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Let God do with it as He wills
12楼2012-04-11 21:26:44
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风逝zhilv

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
还有一点个人呢觉得很重要的就是，加样的时候手法要一致、要准，操作中的一点点误差会使扩增后的误差会很大，祝好运！
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为梦想而努力，不做生活的奴隶！
4楼2012-04-11 13:47:05
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可帅儿

银虫 (正式写手)
我之前也在做REAL TIME PCR，有一些感悟，分享一下。我也是新人，可能不够专业，请指教。
就是说：配好体系后需要将管子离心，让所有液体聚集在管底，最好不要有气泡；
加样时不要反复吹打液体，虽然有混匀的意思，但是会造成污染和试剂的浪费。
移液器我用的芬兰大龙的。使用方法我也要学习的，呵呵。
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追随自己的心！不要做让自己后悔的事！
15楼2012-04-12 18:49:53
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普通回帖

莎姑子

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 风逝zhilv at 2012-04-11 13:47:05:
还有一点个人呢觉得很重要的就是，加样的时候手法要一致、要准，操作中的一点点误差会使扩增后的误差会很大，祝好运！

加样的时候手法要一致、要准，
我觉得问题就出在这句话上啊，关键就是怎样才能做到一致，精准呢？
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5楼2012-04-11 15:23:25
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莎姑子

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-11 11:45:29:
嗯.............
偶来了
1. 加样枪最好专用，并定期矫正，能使用吉尔森某款具有锁定功能的枪最好，eppendorf的reserch系列好像基本都没有锁定量程功能
2. 技术误差大，有一部分也是你没有混合好PCR成分的原因， ...

我们用的枪是eppndorf和的枪头都是进口的，这些都不是问题，貌似就是我的实验操作上的一些细节没有注意到吧，模板加样量是1ul.还请指导啊
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6楼2012-04-11 15:25:59
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莎姑子

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-11 13:08:48:
一楼专家解释的已经很完整了。人家很专业，咱没法比，但是我的小经验还是送给你吧。感觉你的问题不是出在污染这一块，而是稀释的时候没做好，导致Ct值变化不呈现一定的规律性。由于八排连管容量小，加之你的体系少 ...

不是稀释这块的问题，貌似是配预混合体系和加模板的时候的一些细节问题
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7楼2012-04-11 15:28:49
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-11 12:45:29:
嗯.............
偶来了
1. 加样枪最好专用，并定期矫正，能使用吉尔森某款具有锁定功能的枪最好，eppendorf的reserch系列好像基本都没有锁定量程功能
2. 技术误差大，有一部分也是你没有混合好PCR成分的原因， ...

请问二档吸取一档打是什么意思？最近也在做定量，不是很懂
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向着目标前进！
8楼2012-04-11 18:44:56
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莎姑子

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 蓝慧 at 2012-04-11 18:44:56:
请问二档吸取一档打是什么意思？最近也在做定量，不是很懂

这个二档吸取一档打是个什么意思哦，我也想同问啊，应该要这样做吗？
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9楼2012-04-11 18:47:00
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