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莎姑子

银虫 (初入文坛)

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[求助] Real-Time PCR加样过程中的那些细节

急求各位高手哥哥姐姐帮忙啊
做实时荧光定量PCR，做扩增效率的曲线R2如何才能达到0.99以上，加样过程中有哪些细节需要注意的，使用枪的过程中又有哪些需要注意的，各位高手指点下吧，每次做出来的曲线基本都不好，愁死我了啊

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real time-pcr

QPCR 问题简答

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1楼 2012-04-11 11:29:56

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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆不喜欢发脾气

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 热心又专业，欢迎常来本版，建议做专家顾问吧 2012-04-11 13:57:15
莎姑子: 金币+2, ★有帮助 2012-04-11 15:27:03

嗯.............
偶来了
1. 加样枪最好专用，并定期矫正，能使用吉尔森某款具有锁定功能的枪最好，eppendorf的reserch系列好像基本都没有锁定量程功能
2. 技术误差大，有一部分也是你没有混合好PCR成分的原因，所有PCR成分在用前必须尽量涡旋完全（不过也有报道指出涡旋对酶不好，所以要是担心这点，请颠倒混匀20X以上以达到充分效果）
3. 模板和Mix混合时，尽量选择稀释过的模板，不要取0.5ul以下体积的模板，稍微枪头上带点的话，就能引起误差，如果非要选择吸取0.5ul以下的模板，请采用倒置吸量法，即二档吸取一档打。混合时强烈涡旋1min以上
4. 加样请使用优质硅化枪头，绝对要一次打干净液体，若用96孔板，倾斜一定角度贴壁缓慢（不是很慢的那种）加比较有效果，若用8连管，枪头贴壁倾斜角度反而不能过大，同时注意不要加到盖子能碰到的地方
以上个人经验若有说错希望高手指正哦

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Let God do with it as He wills

2楼2012-04-11 11:45:29

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atlanticwi

金虫 (正式写手)

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西瓜: 金币+2, Good 2012-04-11 21:59:55

引用回帖:

8楼: Originally posted by 蓝慧 at 2012-04-11 18:44:56:
请问二档吸取一档打是什么意思？最近也在做定量，不是很懂

.......................
不是我的帖子你们不引用我的话我是看不到的好在闲逛回来咯

移液器本身有四种用法，当然其他两种我们也用不到，经常用到的两种其一是我们正常移液法，一档吸取，二档打空。第二种则专门针对移去极微量液体（但在移液器量程内，通常指2.5ul移液器的0.1~0.5ul范围内）或粘稠易挥发液体，将正常使用的移液方法倒过来用就可了，二档吸取，一档打空。虽然会浪费一些，但是对极微量模板的加样是有好处的，有兴趣可以尝试下，但当加样量超过0.5ul时，这样做就没有什么必要了

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Let God do with it as He wills

12楼2012-04-11 21:26:44

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