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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Real-Time PCR加样过程中的那些细节
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谈木头

金虫 (小有名气)
★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励下！ 2012-04-12 11:16:14
1.预先多配一个体积的混合液再加到每个孔
2.加样后离心要久一会
3.加热板加热是否均匀
一点小补充，不知道有没有用
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11楼2012-04-11 20:40:40
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★ ★
西瓜: 金币+2, Good 2012-04-11 21:59:55
引用回帖:
8楼: Originally posted by 蓝慧 at 2012-04-11 18:44:56:
请问二档吸取一档打是什么意思？最近也在做定量，不是很懂

.......................
不是我的帖子你们不引用我的话 我是看不到的 好在闲逛回来咯

移液器本身有四种用法，当然其他两种我们也用不到，经常用到的两种其一是我们正常移液法，一档吸取，二档打空。第二种则专门针对移去极微量液体（但在移液器量程内，通常指2.5ul移液器的0.1~0.5ul范围内）或粘稠易挥发液体，将正常使用的移液方法倒过来用就可了，二档吸取，一档打空。虽然会浪费一些，但是对极微量模板的加样是有好处的，有兴趣可以尝试下，但当加样量超过0.5ul时，这样做就没有什么必要了
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Let God do with it as He wills
12楼2012-04-11 21:26:44
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lixilei1314

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-11 21:26:44:
.......................
不是我的帖子你们不引用我的话 我是看不到的 好在闲逛回来咯

移液器本身有四种用法，当然其他两种我们也用不到，经常用到的两种其一是我们正常移液法，一档吸取，二档打空 ...

长见识了，赞一个！
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13楼2012-04-12 14:22:37
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莎姑子

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-11 21:26:44:
.......................
不是我的帖子你们不引用我的话 我是看不到的 好在闲逛回来咯

移液器本身有四种用法，当然其他两种我们也用不到，经常用到的两种其一是我们正常移液法，一档吸取，二档打空 ...

呵呵，确实是长见识了啊
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14楼2012-04-12 18:21:51
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可帅儿

银虫 (正式写手)
我之前也在做REAL TIME PCR，有一些感悟，分享一下。我也是新人，可能不够专业，请指教。
就是说：配好体系后需要将管子离心，让所有液体聚集在管底，最好不要有气泡；
加样时不要反复吹打液体，虽然有混匀的意思，但是会造成污染和试剂的浪费。
移液器我用的芬兰大龙的。使用方法我也要学习的，呵呵。
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追随自己的心！不要做让自己后悔的事！
15楼2012-04-12 18:49:53
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biosafety

铁杆木虫 (正式写手)
个人想法，RT-PCR不是真正的数字定量，属于模拟信号的那种。所以要想符合线性度和扩增效率的要求，关键在与标准曲线梯度的设置，梯度越宽，线性度越好。
其次是加样，主要还是模板的加入，一般采用大体积，平行间误差会小一些。
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科学-哲学-神学-玄学
16楼2012-04-13 02:47:08
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莎姑子

银虫 (初入文坛)
感谢各位大虾支招啊，跪谢咯，确实长见识了啊
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17楼2012-04-13 12:21:51
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常晨城
18楼2012-05-18 22:29:22
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ncaty

银虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-11 21:26:44:
.......................
不是我的帖子你们不引用我的话 我是看不到的 好在闲逛回来咯

移液器本身有四种用法，当然其他两种我们也用不到，经常用到的两种其一是我们正常移液法，一档吸取，二档打空 ...

这样的方法可以减少黏在枪头外面的液体带来的误差嘛?
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19楼2012-05-18 23:15:47
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
19楼: Originally posted by ncaty at 2012-05-18 23:15:47:
这样的方法可以减少黏在枪头外面的液体带来的误差嘛?

嗯.................
       这种方法一是针对粘稠液体配合预吸方式来移液 当然这在qPCR中是碰不到的 另一种就是微量液体的吸取
       但是对你所说的黏在外部的液体 怎么都不是以这种方式来去除的吧 枪头外液体本身因为2x预混液和引物液就不是很容易粘在枪头外壁 若有粘附 你在ep管口将其蹭掉也就可以了
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Let God do with it as He wills
20楼2012-05-18 23:23:29
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