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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 荧光定量pcr溶解曲线好几个峰，但是电泳只有一条目的条带，怎么回事
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云淡风轻win

铁虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量pcr溶解曲线好几个峰，但是电泳只有一条目的条带，怎么回事

我刚开始做荧光定量pcr，用的是绝对定量，染料法，之前在普通pcr上面摸索过的引物，只能跑出特异性条带，不知道为什么在定量pcr后，扩增效率不怎么高，且溶解曲线有好几个峰，更加诡异的是，我将定量pcr的产物去跑电泳之后，只能跑出来一条目的条带，并且很清晰，很明亮，没有其他的杂带，我想问一下大家，这是怎么回事呢？
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1楼 2012-08-10 19:09:34
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
初始PCR只有1条带，不能说明是一个序列，你可以把你的PCR产物连接到载体上做个转化后提质粒，尽量多测几个序，因为有可能你看的一条带是几个分子量大小一致而不同的序列混合而成。如果是混合物，QPCR有几个峰值也不足为奇哈。我刚刚遇到过类似现象。
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2楼2012-08-10 22:12:46
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云淡风轻win

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-10 22:12:46
初始PCR只有1条带，不能说明是一个序列，你可以把你的PCR产物连接到载体上做个转化后提质粒，尽量多测几个序，因为有可能你看的一条带是几个分子量大小一致而不同的序列混合而成。如果是混合物，QPCR有几个峰值也不 ...

如果这样的话，定量pcr的时候几个峰应该很接近呀，但是我的溶解曲线几个峰都离得不近呀？
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3楼2012-08-11 00:05:28
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
云淡风轻win: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-08-11 13:52:36
引用回帖:
3楼: Originally posted by 云淡风轻win at 2012-08-11 00:05:28
如果这样的话，定量pcr的时候几个峰应该很接近呀，但是我的溶解曲线几个峰都离得不近呀？...

如果离的不近，那极有可能是2个分子量不一致的带。这种情况我也遇到过，跑胶是1条带，但是实际上连到载体上后测序是分子量差10多个bp的。建议楼主测个序看。
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4楼2012-08-11 11:13:00
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chenhuize

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
云淡风轻win: 金币+1, ★有帮助 2012-08-14 20:06:11
建议你多测几个序看看。胶上的分辨率毕竟很有限。
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5楼2012-08-14 09:29:51
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云淡风轻win

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by chenhuize at 2012-08-14 09:29:51
建议你多测几个序看看。胶上的分辨率毕竟很有限。

谢谢了！换了引物，已经成功了！
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6楼2012-08-14 20:05:57
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