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l_h_10

金虫 (小有名气)

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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助哦 2012-06-22 13:33:39
xuemei1984: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-06-23 09:57:10

从图上看，是引物二聚体的峰有干扰，我觉得可以减少引物量。之前也为这个问题困扰过，我的问题是普通定量出现引物二聚体，实时定量也出现，后面把引物量减少一半就好了（试过把引物量减少一倍或者把模板量加大一倍，发现引物量减少效果更好）。

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2楼2012-06-21 23:03:54

普通回帖

西瓜

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改三步法试试吧，可以显著改善特异性。

3楼2012-06-22 00:56:19

小虫子666

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xuemei1984: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-06-23 09:57:58

从图中我觉得还是引物不合适。建议：较严格按着realtime-PCR引物设计原则设计，引物Tm高些。还有做PCR时，药品颠倒混匀，尤其是SYBR，我在做试验中觉得PCR mixture 混合不好，也影响PCR扩增。这个不错你可以看看《TAKARA荧光定量PCR宝典》

4楼2012-06-22 16:22:31

孙启亮

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xuemei1984: 金币+1, ★有帮助 2012-06-23 09:58:25

你所说的单一条带全部是引物二聚体，换句话说你设计的引物是不合格的，得重新设计引物。实际上你的目的条带并没有扩增出来，所以你尝试改良溶解曲线的时候南辕北辙

5楼2012-06-22 16:47:16

xuemei1984

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

6楼2012-06-23 10:05:39

孙启亮

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引用回帖:

6楼: Originally posted by xuemei1984 at 2012-06-23 10:05:39
我的产物片段是141bp，最后一条marker大小是125bp。而且我做过普通pcr结果也是这样的，并且Tm值84度左右，只是我的目的基因表达量较低，条带较弱，应该不是引物二聚体。...

建议你换DL500marker跑胶，而且从你溶解曲线上看也是有杂峰的，说明可能有引物二聚体的干扰，建议你少加点引物同时提高下退火温度

7楼2012-06-23 10:31:15