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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SYBR荧光定量的溶解曲线
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xuemei1984

禁虫 (小有名气)
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1楼 2012-06-21 20:55:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

l_h_10

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助哦 2012-06-22 13:33:39
xuemei1984: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-06-23 09:57:10
从图上看，是引物二聚体的峰有干扰，我觉得可以减少引物量。之前也为这个问题困扰过，我的问题是普通定量出现引物二聚体，实时定量也出现，后面把引物量减少一半就好了（试过把引物量减少一倍或者把模板量加大一倍，发现引物量减少效果更好）。
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2楼2012-06-21 23:03:54
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普通回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
改三步法试试吧，可以显著改善特异性。
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3楼2012-06-22 00:56:19
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xuemei1984: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-06-23 09:57:58
从图中我觉得还是引物不合适。建议：较严格按着realtime-PCR引物设计原则设计，引物Tm高些。还有做PCR时，药品颠倒混匀，尤其是SYBR，我在做试验中觉得PCR mixture 混合不好，也影响PCR扩增。 这个不错你可以看看《TAKARA荧光定量PCR宝典》
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4楼2012-06-22 16:22:31
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xuemei1984: 金币+1, ★有帮助 2012-06-23 09:58:25
你所说的单一条带全部是引物二聚体，换句话说你设计的引物是不合格的，得重新设计引物。实际上你的目的条带并没有扩增出来，所以你尝试改良溶解曲线的时候南辕北辙
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5楼2012-06-22 16:47:16
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xuemei1984

禁虫 (小有名气)
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6楼2012-06-23 10:05:39
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by xuemei1984 at 2012-06-23 10:05:39
我的产物片段是141bp，最后一条marker大小是125bp。而且我做过普通pcr结果也是这样的，并且Tm值84度左右，只是我的目的基因表达量较低，条带较弱，应该不是引物二聚体。...

建议你换DL500marker跑胶，而且从你溶解曲线上看也是有杂峰的，说明可能有引物二聚体的干扰，建议你少加点引物同时提高下退火温度
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7楼2012-06-23 10:31:15
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xuemei1984

禁虫 (小有名气)
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8楼2012-06-23 10:41:36
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xuemei1984 at 2012-06-23 10:41:36
引物设计时，两个软件计算的Tm值都挺高的，符合要求。只是引物合成回来Tm值低了好多。...

引物合成回来Tm值低了好多更说明你的引物不合适了，引物间GC AT分布不够均匀，建议用2个引物设计软件都去检测Tm，（我是这样做的）
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9楼2012-06-23 15:55:11
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sanmiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你平时扩增，都用三部的！你Real-time是可以用三步法啊，很好用啊，基本上跟你平时做普通PCR一样啊！这是将每一步的时间缩短一点就OK了啊！
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10楼2013-04-27 10:31:42
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