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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 扩增曲线不平滑是怎么回事？
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可帅儿

银虫 (正式写手)

[交流] 扩增曲线不平滑是怎么回事？

我又来了。。。
今天又做了一批荧光PCR，最后的结果是大致的曲线走向都对的，就是有个问题曲线不够平滑。图在下面。以前做了几次也有这个问题呢~请问这会是什么原因？
P.S.我用的是ABI7500做的，想同时做出扩增曲线和溶解曲线，请问有木有熟悉仪器的大虾，应该怎么setup才行呢？貌似实验type只能是一种。。。
配工作液还不太熟练，我怕配错；于是想一管一管加，这样至少不会有差错。










这是4个重复的反应，用的是50ul体系












这也是4个重复的，但是100ul体系，貌似效果比50 的好



[ Last edited by 可帅儿 on 2012-4-19 at 13:42 ]
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1楼2012-04-17 15:30:17
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atlanticwi

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 金币+4, Good！ 2012-04-22 19:11:17
引用回帖:
21楼: Originally posted by 可帅儿 at 2012-04-21 22:21:05:
呵呵是么这个试剂公司不出名么不清楚哎。。。
有考虑到试剂不太适合机器这个原因
谢谢指点！

嗯..................
ABI的东西固然好，但也不用担心
东洋纺(TOYOBO)的东西也是不错的，一大堆人用他的KOD用的那么带劲的.................没有说试剂不适合机器这种说法，除非那个公司很邪恶的就把自己的产品优化到最好，但通常我觉得不会有这个问题，再说SYBR Green及TaqMan都不是ABI或TOYOBO公司的特有商标，作为Molecular Probes公司的专利，不会说其他公司就使用的不一样哦，虽然Molecular Probes和ABI现在是一个Life Technologies旗下的...................
所以实验的问题基本不会是正牌公司的产品问题 除非你拿到的就是假货，尽量还是优化实验条件吧
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22楼2012-04-22 13:04:32
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普通回帖

可帅儿

银虫 (正式写手)
哎~~自己来顶顶！求大神指点(⊙o⊙)哦
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2楼2012-04-19 13:44:05
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chlorella409

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
可帅儿(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+4, Good！ 2012-04-19 17:27:17
首先我认为扩增曲线不光滑可能时因为还在基线期，其次，你要加溶解曲线的话可以在experiment menu的experiment properties里面选择检测试剂SYBRgreen下面就可以看到include melt curve在前面小框里打钩，第三，工作液可以先mix再分到每个孔里，cDNA最后加

[ Last edited by chlorella409 on 2012-4-19 at 15:55 ]
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3楼2012-04-19 15:53:18
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atlanticwi

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
可帅儿(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+2, Good！ 2012-04-19 17:26:48
嗯...........
感觉体系过大了哦，100uL体系完全没有必要的，同时你用的什么MasterMix呢，还有感觉前面几个图不是不平滑，而是没有起峰呢
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可帅儿
4楼2012-04-19 16:19:06
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孙启亮

金虫 (著名写手)
★ ★
可帅儿(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+1, 专家考核, 同感 2012-04-19 17:27:51
问什么我感觉其实是没扩出来？楼主有没有跑胶？
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5楼2012-04-19 17:18:16
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atlanticwi

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-19 17:18:16:
问什么我感觉其实是没扩出来？楼主有没有跑胶？

同感同感 嘿嘿
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6楼2012-04-19 17:22:52
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
可帅儿(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
4楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-19 16:19:06:
嗯...........
感觉体系过大了哦，100uL体系完全没有必要的，同时你用的什么MasterMix呢，还有感觉前面几个图不是不平滑，而是没有起峰呢

同意~我们才用10uL，钱多的实验室也才用20uL。那玩意可不便宜哦。
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7楼2012-04-19 17:26:40
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倔强的投手

新虫 (小有名气)
★
可帅儿(金币+1): 谢谢参与
我怎么感觉根本就没有扩增出来呢
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8楼2012-04-19 18:25:08
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可帅儿

银虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-19 16:19:06:
嗯...........
感觉体系过大了哦，100uL体系完全没有必要的，同时你用的什么MasterMix呢，还有感觉前面几个图不是不平滑，而是没有起峰呢

我用的是日本东洋纺的TAQMAN MASTER MIX，会不会是和机器不太匹配的原因呢？ 谢谢你！
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9楼2012-04-19 18:29:01
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可帅儿

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-04-19 17:26:40:
同意~我们才用10uL，钱多的实验室也才用20uL。那玩意可不便宜哦。

是不便宜，但为了做验证没办法= =
更糟糕的是刚才发现有一管有一个孔，mix全漏出来了，回头找试剂公司去。。。
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10楼2012-04-19 18:42:09
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可帅儿

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chlorella409 at 2012-04-19 15:53:18:
首先我认为扩增曲线不光滑可能时因为还在基线期，其次，你要加溶解曲线的话可以在experiment menu的experiment properties里面选择检测试剂SYBRgreen下面就可以看到include melt curve在前面小框里打钩，第三，工 ...

谢谢你哈！
我才发现自己做的是taqman的，没有溶解曲线。。。呵呵
工作液的话我也有配，但是不习惯，最后一管总是不够，于是就做NTC了。能不能直接把试剂加到小管里呢
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11楼2012-04-19 18:54:06
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可帅儿

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-19 17:18:16:
问什么我感觉其实是没扩出来？楼主有没有跑胶？

请问是之前跑还是之后跑呢？
之前的有跑过，有条带的。。。
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12楼2012-04-19 18:55:03
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孙启亮

金虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
12楼: Originally posted by 可帅儿 at 2012-04-19 18:55:03:
请问是之前跑还是之后跑呢？
之前的有跑过，有条带的。。。

在你这个曲线出现之后，跑他的PCR产物
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13楼2012-04-19 18:58:06
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可帅儿

银虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 倔强的投手 at 2012-04-19 18:25:08:
我怎么感觉根本就没有扩增出来呢

好吧，太失败了。我也在找原因呢，头疼的
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14楼2012-04-19 18:58:37
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可帅儿

银虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-19 18:58:06:
在你这个曲线出现之后，跑他的PCR产物

这个没有~如果能跑出来了呢？
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15楼2012-04-19 19:04:37
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孙启亮

金虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 金币+1, 专家考核, 鼓励交流 2012-04-23 18:38:09
引用回帖:
15楼: Originally posted by 可帅儿 at 2012-04-19 19:04:37:
这个没有~如果能跑出来了呢？

曲线不好，要么是你的机器收集荧光信号的时候收不好；要么是你的荧光原因。前者解决方法是换台机器，后者解决方法是换个新荧光（意思是没开封的那种，不是再买一个新的）
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可帅儿
16楼2012-04-19 19:07:36
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可帅儿

银虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
16楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-19 19:07:36:
曲线不好，要么是你的机器收集荧光信号的时候收不好；要么是你的荧光原因。前者解决方法是换台机器，后者解决方法是换个新荧光（意思是没开封的那种，不是再买一个新的）

嗯谢谢您！！！
貌似这台7500真的有点问题。。。回头我再分析下，嘿嘿
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17楼2012-04-19 19:25:44
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love_st

金虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你用taqman的mix跑？那你家探针了么？
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18楼2012-04-19 21:03:19
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chlorella409

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你说的试剂公司没听说过诶，不如买ABI的啊，一组探针也就一千多点。mix的话，你做10个孔就可以配10.8个孔的量，加到最后就够啦，单孔加也不是不可以，但是每个孔的量加的就会有区别，影响实验效果。

[ Last edited by chlorella409 on 2012-4-20 at 09:01 ]
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19楼2012-04-20 08:54:13
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可帅儿

银虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by love_st at 2012-04-19 21:03:19:
你用taqman的mix跑？那你家探针了么？

加了的，是1个探针，跑的相对定量
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20楼2012-04-21 22:19:31
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可帅儿

银虫 (正式写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by chlorella409 at 2012-04-20 08:54:13:
你说的试剂公司没听说过诶，不如买ABI的啊，一组探针也就一千多点。mix的话，你做10个孔就可以配10.8个孔的量，加到最后就够啦，单孔加也不是不可以，但是每个孔的量加的就会有区别，影响实验效果。

呵呵是么这个试剂公司不出名么不清楚哎。。。
有考虑到试剂不太适合机器这个原因
谢谢指点！
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21楼2012-04-21 22:21:05
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可帅儿

银虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-22 13:04:32:
嗯..................
ABI的东西固然好，但也不用担心
东洋纺(TOYOBO)的东西也是不错的，一大堆人用他的KOD用的那么带劲的.................没有说试剂不适合机器这种说法，除非那个公司很邪恶的就把自己的产品 ...

谢谢专家指点！！！
我也觉得有些客观条件应该不会有大碍，但是每次实验结果都不尽人意，看来还是我资质不够好吧。
还想请教一下，抽提好的DNA测定OD值的时候，是不是只有在260nm有吸收峰才正常？我的吸收峰低于220nm，浓度也在10ng/ul以下，这个结果不太正常吧？
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23楼2012-04-23 16:02:08
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
23楼: Originally posted by 可帅儿 at 2012-04-23 16:02:08:
谢谢专家指点！！！
我也觉得有些客观条件应该不会有大碍，但是每次实验结果都不尽人意，看来还是我资质不够好吧。
还想请教一下，抽提好的DNA测定OD值的时候，是不是只有在260nm有吸收峰才正常？我的吸收峰 ...

你的吸收峰低于220nm，可能就是DNA浓度太低啦，背景的信号相对强了些。
你是什么DNA？10ng/uL实在太少啦。
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可帅儿
24楼2012-04-23 18:43:39
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可帅儿

银虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
24楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-04-23 18:43:39:
你的吸收峰低于220nm，可能就是DNA浓度太低啦，背景的信号相对强了些。
你是什么DNA？10ng/uL实在太少啦。

样本的血迹样本，是人类基因组样本。我也觉得太低了。
但是试剂盒说明书上写了最后得到的DNA浓度大约为1ng/ul，这算正常吗？
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西瓜
25楼2012-04-23 20:07:42
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
送鲜花一朵
引用回帖:
25楼: Originally posted by 可帅儿 at 2012-04-23 20:07:42:
样本的血迹样本，是人类基因组样本。我也觉得太低了。
但是试剂盒说明书上写了最后得到的DNA浓度大约为1ng/ul，这算正常吗？

额，那应该没太大问题吧。不过个人还是觉得偏低了些。
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26楼2012-04-23 21:54:40
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txw87

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
同学，加ROX了么？看你的荧光值貌似没加。abi的实时程序一般都是默认有ROX检验的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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27楼2012-05-04 00:32:22
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txw87

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-07 17:55:51
还有啊，你做taqman法还想做熔解曲线那是不可能的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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28楼2012-05-04 00:34:23
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可帅儿

银虫 (正式写手)
引用回帖:
28楼: Originally posted by txw87 at 2012-05-04 00:34:23:
还有啊，你做taqman法还想做熔解曲线那是不可能的

哦哦谢了，我会注意的
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29楼2012-05-04 10:51:46
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txw87

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
29楼: Originally posted by 可帅儿 at 2012-05-04 10:51:46:
哦哦谢了，我会注意的

你加ROX了么？如果没加的话，曲线就会很难看，ABI的仪器都这样
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30楼2012-05-04 11:00:08
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可帅儿

银虫 (正式写手)
引用回帖:
27楼: Originally posted by txw87 at 2012-05-04 00:32:22:
同学，加ROX了么？看你的荧光值貌似没加。abi的实时程序一般都是默认有ROX检验的

请问ROX是什么?我不太明白，请指教
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31楼2012-05-04 11:02:49
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txw87

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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-04 13:51:35
引用回帖:
31楼: Originally posted by 可帅儿 at 2012-05-04 11:02:49:
请问ROX是什么?我不太明白，请指教

ROX是一种参比染料，ABI的仪器在读取荧光信号值时同时也会读取ROX的值，因为ROX的荧光值是恒定的，所以通过这个可以校正孔间差异和每个循环读取信号的不稳定。
仪器配套软件在绘图时是考虑ROX值的，如果你没加的话，曲线就很难看，估计你应该是没加。
这个是可以在设置里修改的，但看你貌似对仪器不熟，所以可能是没把这个选项去掉。
一般的实时反应Mix里都会送两种参比染料，ROX和ROX II，ABI 7500应该加ROX II，其他机型要看试剂说明书。
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可帅儿
32楼2012-05-04 11:09:27
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可帅儿

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引用回帖:
32楼: Originally posted by txw87 at 2012-05-04 11:09:27:
ROX是一种参比染料，ABI的仪器在读取荧光信号值时同时也会读取ROX的值，因为ROX的荧光值是恒定的，所以通过这个可以校正孔间差异和每个循环读取信号的不稳定。
仪器配套软件在绘图时是考虑ROX值的，如果你没加的 ...

谢谢专家指教！
我应该是没加，我用的是mix试剂，这个是要额外加吗？
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33楼2012-05-04 11:18:10
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txw87

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
33楼: Originally posted by 可帅儿 at 2012-05-04 11:18:10:
谢谢专家指教！
我应该是没加，我用的是mix试剂，这个是要额外加吗？

当然要啊，一般ROX都是试剂配套送的，没人单买这玩意
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34楼2012-05-04 11:26:29
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w.king124

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
ABI的机器必须要加Rox校正的，否则跑出来的图没法看的，这一点还是罗氏做的好
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35楼2012-05-05 17:01:17
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可帅儿

银虫 (正式写手)
引用回帖:
35楼: Originally posted by w.king124 at 2012-05-05 17:01:17:
ABI的机器必须要加Rox校正的，否则跑出来的图没法看的，这一点还是罗氏做的好

谢谢指教！
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36楼2012-05-06 14:49:13
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real-gold

银虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
35楼: Originally posted by w.king124 at 2012-05-05 17:01:17:
ABI的机器必须要加Rox校正的，否则跑出来的图没法看的，这一点还是罗氏做的好

ABI的机器没必要一定要加Rox校正吧？  大部分是没有加rox的  曲线也还行啊
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37楼2012-05-06 20:38:03
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atlanticwi

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 金币+3, Good！加不加差别确实不大，不过加了的话重复性好很多，个人经验~ 2012-05-07 17:56:43
引用回帖:
33楼: Originally posted by 可帅儿 at 2012-05-04 11:18:10:
谢谢专家指教！
我应该是没加，我用的是mix试剂，这个是要额外加吗？

大姐啊
幸亏回来看到这帮人在这说了
你应该看看试剂说明书的 ROX染料一般都是直接加入的
我用的TOYOBO Mix就是这样的
你可以看看试剂盒里哪里有什么额外的ROX让你加的啦...........
如果你的Mix是呈现微微一点红色的话 本身就说明有ROX染料的啦..................................
如果有问题 只能是你没有设定去读ROX 而不是没加ROX
再者有没有读ROX的影响我试过 比较微小（也不排除实验条件未优化造成的大差异） 本来ROX是用来矫正孔间差异的，若是有ROX和没有ROX下区别那么大 这个做机器的公司就可以去死了.......................
个人看法 若有说错请高手指点

[ Last edited by atlanticwi on 2012-5-6 at 21:22 ]
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38楼2012-05-06 21:14:41
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q307078056

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这样的图谱，完全就是阴性的曲线·   LZ要查查原因了
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39楼2012-05-06 22:34:30
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txw87

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
38楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-05-06 21:14:41:
大姐啊
幸亏回来看到这帮人在这说了
你应该看看试剂说明书的 ROX染料一般都是直接加入的
我用的TOYOBO Mix就是这样的
你可以看看试剂盒里哪里有什么额外的ROX让你加的啦...........
如果你的Mix是呈现 ...

额，ROX一般应该不是直接加入的吧。

因为除了ABI的仪器，其他仪器是不用ROX的，如果直接加入了，会影响实验结果吧；还有ABI 7300和7500用的也不是同一种ROX，难道要分出不同机型的Mix？

我也是个人看法，因为没用过很多种Mix。

我比较认同你这句话：“如果你的Mix是呈现微微一点红色的话 本身就说明有ROX染料的啦”
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40楼2012-05-06 22:54:46
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40楼: Originally posted by txw87 at 2012-05-06 22:54:46:
额，ROX一般应该不是直接加入的吧。

因为除了ABI的仪器，其他仪器是不用ROX的，如果直接加入了，会影响实验结果吧；还有ABI 7300和7500用的也不是同一种ROX，难道要分出不同机型的Mix？

我也是个人看法，因 ...

嗯......................
       我用过TOYOBO和Invitrogen公司两种Mix 均是直接加入的，TOYOBO产品没有直接注明 Invitrogen公司会写含ROX的XXXXX让人一目了然，并非是ABI的用而其他仪器不用，据我所知大多数仪器都支持ROX，反之则是Roche的LightCycler和Bio-Rad的部分仪器（好像是IQ系列吧）不支持ROX矫正。
       没有用过ABI7300/7500所以不知道多种ROX情况 若你有详细情报，还烦请告知，偶比较感兴趣
       个人看法 有说错的话请指点
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41楼2012-05-06 23:48:11
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41楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-05-06 23:48:11:
嗯......................
       我用过TOYOBO和Invitrogen公司两种Mix 均是直接加入的，TOYOBO产品没有直接注明 Invitrogen公司会写含ROX的XXXXX让人一目了然，并非是ABI的用而其他仪器不用，据我所知大多数仪 ...

你说的也对，我用过的东西也不多。不过个人认为直接加入不是很合理，毕竟混到mix里就要注意避光了。我用的是takara的，是分开的两种，7300用rox，7500用rox II

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atlanticwi
42楼2012-05-07 00:17:55
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42楼: Originally posted by txw87 at 2012-05-07 00:17:55:
你说的也对，我用过的东西也不多。不过个人认为直接加入不是很合理，毕竟混到mix里就要注意避光了。我用的是takara的，是分开的两种，7300用rox，7500用rox II

嗯...............
       嘿嘿 本来SYBR Green就是要避光的啦，所以加不加ROX是一样的，都需要暗处操作.............不过我们老板根本不管..................
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43楼2012-05-07 01:20:06
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42楼: Originally posted by txw87 at 2012-05-07 00:17:55:
你说的也对，我用过的东西也不多。不过个人认为直接加入不是很合理，毕竟混到mix里就要注意避光了。我用的是takara的，是分开的两种，7300用rox，7500用rox II

....................................
刚看了下TaKaRa公司的东西 ROX和ROX II的区别好像只是说浓度高低的......搞不懂为啥这么售 顺便去TaKaRa日本母公司去逛了一下 发现好像并没有ROX单独来售的 都是SYBR Green ROX plus的形式 以前就觉得大连的代理爱瞎整（有些东西母公司都没有，他就能整出来，真不知道咋出来的）..........................
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44楼2012-05-07 01:30:36
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43楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-05-07 01:20:06:
嗯...............
       嘿嘿 本来SYBR Green就是要避光的啦，所以加不加ROX是一样的，都需要暗处操作.............不过我们老板根本不管..................

额，这贴不是讨论taqman的mix嘛

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45楼2012-05-07 07:16:22
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45楼: Originally posted by txw87 at 2012-05-07 07:16:22:
额，这贴不是讨论taqman的mix嘛

嘿嘿嘿嘿 忘了忘了 想起楼主用的TaqMan咯
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46楼2012-05-07 09:56:09
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37楼: Originally posted by real-gold at 2012-05-06 20:38:03:
ABI的机器没必要一定要加Rox校正吧？  大部分是没有加rox的  曲线也还行啊

那请问光学边缘效应怎么处理哩？
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47楼2012-05-07 14:22:58
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w.king124

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西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-07 17:57:22
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41楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-05-06 23:48:11:
嗯......................
       我用过TOYOBO和Invitrogen公司两种Mix 均是直接加入的，TOYOBO产品没有直接注明 Invitrogen公司会写含ROX的XXXXX让人一目了然，并非是ABI的用而其他仪器不用，据我所知大多数仪 ...

ABI的7000,7300,7500都需要加入ROX校正吧，因为好像孔间有光程差，具有光学边缘效应，Biorad好像也需要的，罗氏的LC 480是加装了五棱镜折射，没有光程差，无需Rox校正，而非不支持，Qiagen的rotor Gene Q系列是单独激发单独检测每个管子的荧光信号的，也不需要Rox校正
个人意见，欢迎指正~
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atlanticwi atlanticwi
48楼2012-05-07 14:30:16
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48楼: Originally posted by w.king124 at 2012-05-07 14:30:16:
ABI的7000,7300,7500都需要加入ROX校正吧，因为好像孔间有光程差，具有光学边缘效应，Biorad好像也需要的，罗氏的LC 480是加装了五棱镜折射，没有光程差，无需Rox校正，而非不支持，Qiagen的rotor Gene Q系列是单 ...

哦~~~~~~~~~~~~~~~~~ 高手
学习了 具体原理很感兴趣 但是无从下手 高手指点 真是三生有幸
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49楼2012-05-07 14:55:07
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48楼: Originally posted by w.king124 at 2012-05-07 14:30:16:
ABI的7000,7300,7500都需要加入ROX校正吧，因为好像孔间有光程差，具有光学边缘效应，Biorad好像也需要的，罗氏的LC 480是加装了五棱镜折射，没有光程差，无需Rox校正，而非不支持，Qiagen的rotor Gene Q系列是单 ...

麻烦请问 您那是否有这几个仪器的相关的资料呢？
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50楼2012-05-07 14:59:45
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