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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 扩增曲线不平滑是怎么回事？
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可帅儿

银虫 (正式写手)

[交流] 扩增曲线不平滑是怎么回事？

我又来了。。。
今天又做了一批荧光PCR，最后的结果是大致的曲线走向都对的，就是有个问题曲线不够平滑。图在下面。以前做了几次也有这个问题呢~请问这会是什么原因？
P.S.我用的是ABI7500做的，想同时做出扩增曲线和溶解曲线，请问有木有熟悉仪器的大虾，应该怎么setup才行呢？貌似实验type只能是一种。。。
配工作液还不太熟练，我怕配错；于是想一管一管加，这样至少不会有差错。










这是4个重复的反应，用的是50ul体系












这也是4个重复的，但是100ul体系，貌似效果比50 的好



[ Last edited by 可帅儿 on 2012-4-19 at 13:42 ]
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1楼 2012-04-17 15:30:17
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可帅儿

银虫 (正式写手)
哎~~自己来顶顶！求大神指点(⊙o⊙)哦
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2楼2012-04-19 13:44:05
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可帅儿

银虫 (正式写手)
送鲜花一朵
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4楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-19 16:19:06:
嗯...........
感觉体系过大了哦，100uL体系完全没有必要的，同时你用的什么MasterMix呢，还有感觉前面几个图不是不平滑，而是没有起峰呢

我用的是日本东洋纺的TAQMAN MASTER MIX，会不会是和机器不太匹配的原因呢？ 谢谢你！
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9楼2012-04-19 18:29:01
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可帅儿

银虫 (正式写手)
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7楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-04-19 17:26:40:
同意~我们才用10uL，钱多的实验室也才用20uL。那玩意可不便宜哦。

是不便宜，但为了做验证没办法= =
更糟糕的是刚才发现有一管有一个孔，mix全漏出来了，回头找试剂公司去。。。
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10楼2012-04-19 18:42:09
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可帅儿

银虫 (正式写手)
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3楼: Originally posted by chlorella409 at 2012-04-19 15:53:18:
首先我认为扩增曲线不光滑可能时因为还在基线期，其次，你要加溶解曲线的话可以在experiment menu的experiment properties里面选择检测试剂SYBRgreen下面就可以看到include melt curve在前面小框里打钩，第三，工 ...

谢谢你哈！
我才发现自己做的是taqman的，没有溶解曲线。。。呵呵
工作液的话我也有配，但是不习惯，最后一管总是不够，于是就做NTC了。能不能直接把试剂加到小管里呢
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11楼2012-04-19 18:54:06
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可帅儿

银虫 (正式写手)
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5楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-19 17:18:16:
问什么我感觉其实是没扩出来？楼主有没有跑胶？

请问是之前跑还是之后跑呢？
之前的有跑过，有条带的。。。
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12楼2012-04-19 18:55:03
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可帅儿

银虫 (正式写手)
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8楼: Originally posted by 倔强的投手 at 2012-04-19 18:25:08:
我怎么感觉根本就没有扩增出来呢

好吧，太失败了。我也在找原因呢，头疼的
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14楼2012-04-19 18:58:37
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可帅儿

银虫 (正式写手)
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13楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-19 18:58:06:
在你这个曲线出现之后，跑他的PCR产物

这个没有~如果能跑出来了呢？
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15楼2012-04-19 19:04:37
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可帅儿

银虫 (正式写手)
送鲜花一朵
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16楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-19 19:07:36:
曲线不好，要么是你的机器收集荧光信号的时候收不好；要么是你的荧光原因。前者解决方法是换台机器，后者解决方法是换个新荧光（意思是没开封的那种，不是再买一个新的）

嗯谢谢您！！！
貌似这台7500真的有点问题。。。回头我再分析下，嘿嘿
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17楼2012-04-19 19:25:44
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可帅儿

银虫 (正式写手)
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18楼: Originally posted by love_st at 2012-04-19 21:03:19:
你用taqman的mix跑？那你家探针了么？

加了的，是1个探针，跑的相对定量
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20楼2012-04-21 22:19:31
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可帅儿

银虫 (正式写手)
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19楼: Originally posted by chlorella409 at 2012-04-20 08:54:13:
你说的试剂公司没听说过诶，不如买ABI的啊，一组探针也就一千多点。mix的话，你做10个孔就可以配10.8个孔的量，加到最后就够啦，单孔加也不是不可以，但是每个孔的量加的就会有区别，影响实验效果。

呵呵是么这个试剂公司不出名么不清楚哎。。。
有考虑到试剂不太适合机器这个原因
谢谢指点！
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21楼2012-04-21 22:21:05
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可帅儿

银虫 (正式写手)
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22楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-04-22 13:04:32:
嗯..................
ABI的东西固然好，但也不用担心
东洋纺(TOYOBO)的东西也是不错的，一大堆人用他的KOD用的那么带劲的.................没有说试剂不适合机器这种说法，除非那个公司很邪恶的就把自己的产品 ...

谢谢专家指点！！！
我也觉得有些客观条件应该不会有大碍，但是每次实验结果都不尽人意，看来还是我资质不够好吧。
还想请教一下，抽提好的DNA测定OD值的时候，是不是只有在260nm有吸收峰才正常？我的吸收峰低于220nm，浓度也在10ng/ul以下，这个结果不太正常吧？
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23楼2012-04-23 16:02:08
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可帅儿

银虫 (正式写手)
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24楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-04-23 18:43:39:
你的吸收峰低于220nm，可能就是DNA浓度太低啦，背景的信号相对强了些。
你是什么DNA？10ng/uL实在太少啦。

样本的血迹样本，是人类基因组样本。我也觉得太低了。
但是试剂盒说明书上写了最后得到的DNA浓度大约为1ng/ul，这算正常吗？
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西瓜
25楼2012-04-23 20:07:42
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可帅儿

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28楼: Originally posted by txw87 at 2012-05-04 00:34:23:
还有啊，你做taqman法还想做熔解曲线那是不可能的

哦哦谢了，我会注意的
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29楼2012-05-04 10:51:46
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27楼: Originally posted by txw87 at 2012-05-04 00:32:22:
同学，加ROX了么？看你的荧光值貌似没加。abi的实时程序一般都是默认有ROX检验的

请问ROX是什么?我不太明白，请指教
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31楼2012-05-04 11:02:49
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32楼: Originally posted by txw87 at 2012-05-04 11:09:27:
ROX是一种参比染料，ABI的仪器在读取荧光信号值时同时也会读取ROX的值，因为ROX的荧光值是恒定的，所以通过这个可以校正孔间差异和每个循环读取信号的不稳定。
仪器配套软件在绘图时是考虑ROX值的，如果你没加的 ...

谢谢专家指教！
我应该是没加，我用的是mix试剂，这个是要额外加吗？
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33楼2012-05-04 11:18:10
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可帅儿

银虫 (正式写手)
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35楼: Originally posted by w.king124 at 2012-05-05 17:01:17:
ABI的机器必须要加Rox校正的，否则跑出来的图没法看的，这一点还是罗氏做的好

谢谢指教！
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36楼2012-05-06 14:49:13
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