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[交流]
扩增曲线不平滑是怎么回事？
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我又来了。。。 今天又做了一批荧光PCR，最后的结果是大致的曲线走向都对的，就是有个问题曲线不够平滑。图在下面。以前做了几次也有这个问题呢~请问这会是什么原因？ P.S.我用的是ABI7500做的，想同时做出扩增曲线和溶解曲线，请问有木有熟悉仪器的大虾，应该怎么setup才行呢？貌似实验type只能是一种。。。  配工作液还不太熟练，我怕配错；于是想一管一管加，这样至少不会有差错。     这是4个重复的反应，用的是50ul体系     这也是4个重复的，但是100ul体系，貌似效果比50 的好 [ Last edited by 可帅儿 on 2012-4-19 at 13:42 ] |
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 金币+4, Good！ 2012-04-22 19:11:17
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嗯.................. ABI的东西固然好，但也不用担心 东洋纺(TOYOBO)的东西也是不错的，一大堆人用他的KOD用的那么带劲的.................没有说试剂不适合机器这种说法，除非那个公司很邪恶的就把自己的产品优化到最好，但通常我觉得不会有这个问题，再说SYBR Green及TaqMan都不是ABI或TOYOBO公司的特有商标，作为Molecular Probes公司的专利，不会说其他公司就使用的不一样哦，虽然Molecular Probes和ABI现在是一个Life Technologies旗下的................... 所以实验的问题基本不会是正牌公司的产品问题 除非你拿到的就是假货，尽量还是优化实验条件吧  |
22楼2012-04-22 13:04:32
2楼2012-04-19 13:44:05
3楼2012-04-19 15:53:18
可帅儿4楼2012-04-19 16:19:06
5楼2012-04-19 17:18:16
6楼2012-04-19 17:22:52
7楼2012-04-19 17:26:40
8楼2012-04-19 18:25:08
9楼2012-04-19 18:29:01
是不便宜，但为了做验证没办法= =10楼2012-04-19 18:42:09
11楼2012-04-19 18:54:06
12楼2012-04-19 18:55:03
13楼2012-04-19 18:58:06
好吧，太失败了。我也在找原因呢，头疼的 14楼2012-04-19 18:58:37
15楼2012-04-19 19:04:37
16楼2012-04-19 19:07:36
17楼2012-04-19 19:25:44
18楼2012-04-19 21:03:19
19楼2012-04-20 08:54:13
20楼2012-04-21 22:19:31
21楼2012-04-21 22:21:05
谢谢专家指点！！！23楼2012-04-23 16:02:08
24楼2012-04-23 18:43:39
25楼2012-04-23 20:07:42
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31楼2012-05-04 11:02:49
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-04 13:51:35
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ROX是一种参比染料，ABI的仪器在读取荧光信号值时同时也会读取ROX的值，因为ROX的荧光值是恒定的，所以通过这个可以校正孔间差异和每个循环读取信号的不稳定。 仪器配套软件在绘图时是考虑ROX值的，如果你没加的话，曲线就很难看，估计你应该是没加。 这个是可以在设置里修改的，但看你貌似对仪器不熟，所以可能是没把这个选项去掉。 一般的实时反应Mix里都会送两种参比染料，ROX和ROX II，ABI 7500应该加ROX II，其他机型要看试剂说明书。 |
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32楼2012-05-04 11:09:27
谢谢专家指教！33楼2012-05-04 11:18:10
34楼2012-05-04 11:26:29
35楼2012-05-05 17:01:17
谢谢指教！ 36楼2012-05-06 14:49:13
37楼2012-05-06 20:38:03
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 金币+3, Good！加不加差别确实不大，不过加了的话重复性好很多，个人经验~ 2012-05-07 17:56:43
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大姐啊 幸亏回来看到这帮人在这说了 你应该看看试剂说明书的 ROX染料一般都是直接加入的 我用的TOYOBO Mix就是这样的 你可以看看试剂盒里哪里有什么额外的ROX让你加的啦........... 如果你的Mix是呈现微微一点红色的话 本身就说明有ROX染料的啦.................................. 如果有问题 只能是你没有设定去读ROX 而不是没加ROX 再者有没有读ROX的影响我试过 比较微小（也不排除实验条件未优化造成的大差异） 本来ROX是用来矫正孔间差异的，若是有ROX和没有ROX下区别那么大 这个做机器的公司就可以去死了....................... 个人看法 若有说错请高手指点  [ Last edited by atlanticwi on 2012-5-6 at 21:22 ] |
38楼2012-05-06 21:14:41
39楼2012-05-06 22:34:30
40楼2012-05-06 22:54:46
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-05-07 13:57:15
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嗯...................... 我用过TOYOBO和Invitrogen公司两种Mix 均是直接加入的，TOYOBO产品没有直接注明 Invitrogen公司会写含ROX的XXXXX让人一目了然，并非是ABI的用而其他仪器不用，据我所知大多数仪器都支持ROX，反之则是Roche的LightCycler和Bio-Rad的部分仪器（好像是IQ系列吧）不支持ROX矫正。 没有用过ABI7300/7500所以不知道多种ROX情况 若你有详细情报，还烦请告知，偶比较感兴趣 个人看法 有说错的话请指点 |
41楼2012-05-06 23:48:11
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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你说的也对，我用过的东西也不多。不过个人认为直接加入不是很合理，毕竟混到mix里就要注意避光了。我用的是takara的，是分开的两种，7300用rox，7500用rox II [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
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42楼2012-05-07 00:17:55
43楼2012-05-07 01:20:06
44楼2012-05-07 01:30:36
45楼2012-05-07 07:16:22
46楼2012-05-07 09:56:09
47楼2012-05-07 14:22:58
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ABI的7000,7300,7500都需要加入ROX校正吧，因为好像孔间有光程差，具有光学边缘效应，Biorad好像也需要的，罗氏的LC 480是加装了五棱镜折射，没有光程差，无需Rox校正，而非不支持，Qiagen的rotor Gene Q系列是单独激发单独检测每个管子的荧光信号的，也不需要Rox校正 个人意见，欢迎指正~ |
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48楼2012-05-07 14:30:16
49楼2012-05-07 14:55:07
50楼2012-05-07 14:59:45
