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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 怎么判断非特异性扩增
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柠檬m97

银虫 (小有名气)

[求助] 怎么判断非特异性扩增已有3人参与

我最近在做某中药ISSR单因素考察，好多文献上说引物或dNTP等浓度过高会引起错配以及非特异性扩增，我怎么判断是非特异性扩增而不是就该跑出来的条带呢。。。。
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1楼2014-01-17 10:05:32
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Be_Abuse

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-17 12:47:41
是定量PCR还是普通pcr，出现非特异扩增的因素很多，引物的设计、浓度、dNTP和模版的浓度都会有影响。如果是普通PCR要看条带是否单一，定量的话加个溶解曲线看下是否是特异扩增。
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2楼2014-01-17 10:48:45
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2014-01-17 13:05:22
就单因素，做浓度梯度
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做一个阳光、开朗的小和尚
3楼2014-01-17 12:54:59
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rebubble

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
先根据条带的位置比对DNA分子的大小是否对
觉得差不多大小再测序一下
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4楼2014-01-17 14:29:09
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柠檬m97

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Be_Abuse at 2014-01-17 10:48:45
是定量PCR还是普通pcr，出现非特异扩增的因素很多，引物的设计、浓度、dNTP和模版的浓度都会有影响。如果是普通PCR要看条带是否单一，定量的话加个溶解曲线看下是否是特异扩增。

普通PCR，用来比较不同产地的。下面是正交结果图，就是像第三条就比第二条上面多了个条带，就不知道这个条带是不是错配啥的。。。
怎么判断非特异性扩增
正交.jpg
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5楼2014-01-17 22:25:14
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柠檬m97

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhaozhibozhi at 2014-01-17 12:54:59
就单因素，做浓度梯度

恩，做了呢，下面的图考察的是DNA的浓度，第七个条带就上面多出一条来，不太明白啊，不知道怎么选择了。
怎么判断非特异性扩增-1
DNA.jpg
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6楼2014-01-17 22:28:11
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柠檬m97

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by rebubble at 2014-01-17 14:29:09
先根据条带的位置比对DNA分子的大小是否对
觉得差不多大小再测序一下

我只做ISSR，所以只看条带特异性，不知道DNA分子应该多大呢。。
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7楼2014-01-17 22:29:18
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-28 18:02:26
引用回帖:
6楼: Originally posted by 柠檬m97 at 2014-01-17 22:28:11
恩，做了呢，下面的图考察的是DNA的浓度，第七个条带就上面多出一条来，不太明白啊，不知道怎么选择了。

DNA.jpg
...

个人觉得，这可以指导你统计数据。比如在某DNA浓度之上，开始出现某条带，那么你处理不同样品时，就需要注意DNA浓度了。如果你所有样品dna浓度都在这个阈值之上，就可以统计这条带；如果有高有低，这条带就不能反应真实情况。所以，该结果可以指导你的不同样品的DNA要选定一个浓度范围。
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柠檬m97
做一个阳光、开朗的小和尚
8楼2014-01-18 10:21:14
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柠檬m97

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhaozhibozhi at 2014-01-18 10:21:14
个人觉得，这可以指导你统计数据。比如在某DNA浓度之上，开始出现某条带，那么你处理不同样品时，就需要注意DNA浓度了。如果你所有样品dna浓度都在这个阈值之上，就可以统计这条带；如果有高有低，这条带就不能反应 ...

恩 有道理！我控制所有产地DNA的量试试~
还有个问题，我正交做完是不是还得考察循环次数呢
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9楼2014-01-18 15:49:22
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 柠檬m97 at 2014-01-18 15:49:22
恩 有道理！我控制所有产地DNA的量试试~
还有个问题，我正交做完是不是还得考察循环次数呢...

你优化体系的目的，是不同重复之间出现稳定的、可分辨的条带，也就是避免出现“uneven amplification of some loci”。只要达到这个目的就行。

至于循环次数，可以考察一下。它所带来的影响和其它因素差不多，过高也容易出现非特异性、不稳定条带。总之，最终拿到条带明亮、重复之间稳定的方案就万事ok了。

预祝顺利
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做一个阳光、开朗的小和尚
10楼2014-01-18 17:08:14
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