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[交流]
QPCR扩增效率太低
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大家好，我做QPCR基因扩增效率的时候，一个基因由于CT太大，所以只进行4个2倍的稀释度，二步法退火温度是61度扩增效率不高只有78%（图1）溶解曲线（图3），所以我做了三步法退火温度59度扩增效率反而更低了只有57%（图2）溶解曲线（图4），很奇怪，请教下大家看这是什么原因，该怎么改进呢？有看到资料说把引物浓度提高，不知道效果怎样。 图1.jpg  图2.jpg  图3.jpg  图4.jpg |
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2楼2013-02-27 09:40:24
3楼2013-02-27 12:57:32
★
shiliyusly(金币+1): 谢谢参与
shiliyusly(金币+1): 谢谢参与
| 基因丰度不够，CT数太大造成的。如果样品的CT值过高定量也不准确。你可以试试加大模板用量，或者逆转录时在反应体系中加入目的基因特异性3'引物。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
shiliyusly4楼2013-02-27 13:27:56
5楼2013-02-27 16:12:12
6楼2013-02-27 16:14:04
7楼2013-02-27 16:19:05
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-02-28 10:37:45
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-02-28 10:37:45
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遇到这种情况我有两个做法。一个是PCR时内标与丰度低的基因用不同量模板，使它们的CT值在20-30，计算的时候能够把模板用量差别算进去。丰度实在差别太大的话，反转录时引入低丰度基因特异引物提高其反转录效率，但是这样做引入的差别是无法计算回去的。如果你要做不同样品的相对表达，第二种做法也是可以的，只是无法衡量基因表达的绝对丰度。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
8楼2013-02-28 06:43:53
9楼2013-02-28 07:45:44
10楼2013-02-28 09:14:27
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刚才我把这个基因做扩增效率的4个浓度中最小浓度去掉了（CT值39），就剩了3个浓度的扩增效率有102%了，溶解曲线图和扩增效率曲线如下图：  A8NV9Y92791ETS2])((LB`G.jpg  (DVP632Y0]JBHW){}E`_H8H.jpg  5HJGZ@W7$A~7[W~W)KHNO5J.jpg 但是我用相同方法把相同浓度梯度，三步法和退火温度低2度反应的最低浓度去掉后，扩增效率只有73%，不是应该更大吗？你看我上面得到的102%可信吗？我平时做的杨梅这个基因CT是36左右。 [ Last edited by shiliyusly on 2013-2-28 at 15:53 ] |
11楼2013-02-28 15:47:52
12楼2013-03-01 00:37:22
13楼2013-03-01 12:22:54
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21楼2015-04-24 10:31:17
