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shiliyusly

新虫 (小有名气)


[交流] QPCR扩增效率太低

大家好,我做QPCR基因扩增效率的时候,一个基因由于CT太大,所以只进行4个2倍的稀释度,二步法退火温度是61度扩增效率不高只有78%(图1)溶解曲线(图3),所以我做了三步法退火温度59度扩增效率反而更低了只有57%(图2)溶解曲线(图4),很奇怪,请教下大家看这是什么原因,该怎么改进呢?有看到资料说把引物浓度提高,不知道效果怎样。

图1.jpg



图2.jpg



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shiliyusly

新虫 (小有名气)


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引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-28 06:43:53
遇到这种情况我有两个做法。一个是PCR时内标与丰度低的基因用不同量模板,使它们的CT值在20-30,计算的时候能够把模板用量差别算进去。丰度实在差别太大的话,反转录时引入低丰度基因特异引物提高其反转录效率,但 ...

你说的第一种方法,可不可以这样理解如果丰度低的引物用2倍的模板,内标不变,他们的CT值都在20-30,计算相对表达的时候,将丰度低的基因的CT值减半后再与内标基因进行计算呢?
9楼2013-02-28 07:45:44
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wqj1988926

金虫 (正式写手)



shiliyusly(金币+1): 谢谢参与
应该是引物不合适
2楼2013-02-27 09:40:24
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chenyuqin

新虫 (小有名气)



shiliyusly(金币+1): 谢谢参与
分析一下你的基因,拷贝数怎么样,可以增加循环数
3楼2013-02-27 12:57:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)



shiliyusly(金币+1): 谢谢参与
基因丰度不够,CT数太大造成的。如果样品的CT值过高定量也不准确。你可以试试加大模板用量,或者逆转录时在反应体系中加入目的基因特异性3'引物。

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4楼2013-02-27 13:27:56
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