[交流] QPCR扩增效率太低

2楼: Originally posted by wqj1988926 at 2013-02-27 09:40:24
应该是引物不合适

3楼: Originally posted by chenyuqin at 2013-02-27 12:57:32
分析一下你的基因，拷贝数怎么样，可以增加循环数

4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-27 13:27:56
基因丰度不够，CT数太大造成的。如果样品的CT值过高定量也不准确。你可以试试加大模板用量，或者逆转录时在反应体系中加入目的基因特异性3'引物。

7楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-02-27 16:19:05
非常感谢您！这个基因的确丰度很低，如果加大模板用量的话，我的内标基因也得加大了哦，因为我最终要与内标比的，不知道这样会不会又影响内标基因的扩增效率了...

8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-28 06:43:53
遇到这种情况我有两个做法。一个是PCR时内标与丰度低的基因用不同量模板，使它们的CT值在20-30，计算的时候能够把模板用量差别算进去。丰度实在差别太大的话，反转录时引入低丰度基因特异引物提高其反转录效率，但 ...

9楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-02-28 07:45:44
你说的第一种方法，可不可以这样理解如果丰度低的引物用2倍的模板，内标不变，他们的CT值都在20-30，计算相对表达的时候，将丰度低的基因的CT值减半后再与内标基因进行计算呢？...

10楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-28 09:14:27
模板浓度2倍，CT值为原模板浓度的CT-1。所以把2倍浓度的样品的CT+1就可以了。这种做法用于微调。我说的第二种做法是因为丰度实在相差非常多，第一种做法也很难达到预期效果时用的。...

11楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-02-28 15:47:52
刚才我把这个基因做扩增效率的4个浓度中最小浓度去掉了（CT值39），就剩了3个浓度的扩增效率有102%了，溶解曲线图和扩增效率曲线如下图：

A8NV9Y92791ETS2])((LB`G.jpg



(DVP632Y0]JBHW){}E`_H8H.jp ...

12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-01 00:37:22
CT值在35以上的一般不要用，尽量弄在30以下，实在不行的话33以下。模板浓度很稀的情况，PCR的效率无法接近100%，也就是说增加一个循环，产物浓度不是原来的2倍。...

13楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-03-01 12:22:54
那这个102%扩增效率数据说明不了是好的扩增吗？...

14楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-02 04:37:29
CT值太小或者太大都不是很好。鉴定你的引物的扩增效率到底怎么样需要模板量在一定范围内来做。...

16楼: Originally posted by qishimi at 2013-11-24 10:19:29
怎么算扩增效率 谢谢啦