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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » QPCR扩增效率太低
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shiliyusly

新虫 (小有名气)

[交流] QPCR扩增效率太低

大家好，我做QPCR基因扩增效率的时候，一个基因由于CT太大，所以只进行4个2倍的稀释度，二步法退火温度是61度扩增效率不高只有78%（图1）溶解曲线（图3），所以我做了三步法退火温度59度扩增效率反而更低了只有57%（图2）溶解曲线（图4），很奇怪，请教下大家看这是什么原因，该怎么改进呢？有看到资料说把引物浓度提高，不知道效果怎样。

图1.jpg



图2.jpg



图3.jpg



图4.jpg
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1楼 2013-02-26 23:05:23
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
★
shiliyusly(金币+1): 谢谢参与
应该是引物不合适
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2楼2013-02-27 09:40:24
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chenyuqin

新虫 (小有名气)
★
shiliyusly(金币+1): 谢谢参与
分析一下你的基因，拷贝数怎么样，可以增加循环数
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3楼2013-02-27 12:57:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
shiliyusly(金币+1): 谢谢参与
基因丰度不够，CT数太大造成的。如果样品的CT值过高定量也不准确。你可以试试加大模板用量，或者逆转录时在反应体系中加入目的基因特异性3'引物。
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shiliyusly
4楼2013-02-27 13:27:56
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wqj1988926 at 2013-02-27 09:40:24
应该是引物不合适

谢谢你！溶解曲线也没看到二聚体或者非特异性扩增等，怎么判断是引物不合适呢？不过这个基因表达丰度本来就是很低的。如果要换引物该怎么改进呢？
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5楼2013-02-27 16:12:12
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chenyuqin at 2013-02-27 12:57:32
分析一下你的基因，拷贝数怎么样，可以增加循环数

谢谢你，最大浓度CT值34了，循环数40个，样品测的CT值也是30多
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6楼2013-02-27 16:14:04
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
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4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-27 13:27:56
基因丰度不够，CT数太大造成的。如果样品的CT值过高定量也不准确。你可以试试加大模板用量，或者逆转录时在反应体系中加入目的基因特异性3'引物。

非常感谢您！这个基因的确丰度很低，如果加大模板用量的话，我的内标基因也得加大了哦，因为我最终要与内标比的，不知道这样会不会又影响内标基因的扩增效率了
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7楼2013-02-27 16:19:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-02-28 10:37:45
引用回帖:
7楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-02-27 16:19:05
非常感谢您！这个基因的确丰度很低，如果加大模板用量的话，我的内标基因也得加大了哦，因为我最终要与内标比的，不知道这样会不会又影响内标基因的扩增效率了...

遇到这种情况我有两个做法。一个是PCR时内标与丰度低的基因用不同量模板，使它们的CT值在20-30，计算的时候能够把模板用量差别算进去。丰度实在差别太大的话，反转录时引入低丰度基因特异引物提高其反转录效率，但是这样做引入的差别是无法计算回去的。如果你要做不同样品的相对表达，第二种做法也是可以的，只是无法衡量基因表达的绝对丰度。
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shiliyusly
8楼2013-02-28 06:43:53
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-28 06:43:53
遇到这种情况我有两个做法。一个是PCR时内标与丰度低的基因用不同量模板，使它们的CT值在20-30，计算的时候能够把模板用量差别算进去。丰度实在差别太大的话，反转录时引入低丰度基因特异引物提高其反转录效率，但 ...

你说的第一种方法，可不可以这样理解如果丰度低的引物用2倍的模板，内标不变，他们的CT值都在20-30，计算相对表达的时候，将丰度低的基因的CT值减半后再与内标基因进行计算呢？
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9楼2013-02-28 07:45:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-02-28 10:37:58
引用回帖:
9楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-02-28 07:45:44
你说的第一种方法，可不可以这样理解如果丰度低的引物用2倍的模板，内标不变，他们的CT值都在20-30，计算相对表达的时候，将丰度低的基因的CT值减半后再与内标基因进行计算呢？...

模板浓度2倍，CT值为原模板浓度的CT-1。所以把2倍浓度的样品的CT+1就可以了。这种做法用于微调。我说的第二种做法是因为丰度实在相差非常多，第一种做法也很难达到预期效果时用的。
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10楼2013-02-28 09:14:27
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-28 09:14:27
模板浓度2倍，CT值为原模板浓度的CT-1。所以把2倍浓度的样品的CT+1就可以了。这种做法用于微调。我说的第二种做法是因为丰度实在相差非常多，第一种做法也很难达到预期效果时用的。...

刚才我把这个基因做扩增效率的4个浓度中最小浓度去掉了（CT值39），就剩了3个浓度的扩增效率有102%了，溶解曲线图和扩增效率曲线如下图：

A8NV9Y92791ETS2])((LB`G.jpg



(DVP632Y0]JBHW){}E`_H8H.jpg



5HJGZ@W7$A~7[W~W)KHNO5J.jpg
但是我用相同方法把相同浓度梯度，三步法和退火温度低2度反应的最低浓度去掉后，扩增效率只有73%，不是应该更大吗？你看我上面得到的102%可信吗？我平时做的杨梅这个基因CT是36左右。

[ Last edited by shiliyusly on 2013-2-28 at 15:53 ]
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11楼2013-02-28 15:47:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
11楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-02-28 15:47:52
刚才我把这个基因做扩增效率的4个浓度中最小浓度去掉了（CT值39），就剩了3个浓度的扩增效率有102%了，溶解曲线图和扩增效率曲线如下图：

A8NV9Y92791ETS2])((LB`G.jpg



(DVP632Y0]JBHW){}E`_H8H.jp ...

CT值在35以上的一般不要用，尽量弄在30以下，实在不行的话33以下。模板浓度很稀的情况，PCR的效率无法接近100%，也就是说增加一个循环，产物浓度不是原来的2倍。
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12楼2013-03-01 00:37:22
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-01 00:37:22
CT值在35以上的一般不要用，尽量弄在30以下，实在不行的话33以下。模板浓度很稀的情况，PCR的效率无法接近100%，也就是说增加一个循环，产物浓度不是原来的2倍。...

那这个102%扩增效率数据说明不了是好的扩增吗？
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13楼2013-03-01 12:22:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★
shiliyusly: 金币+5 2013-03-02 10:31:26
引用回帖:
13楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-03-01 12:22:54
那这个102%扩增效率数据说明不了是好的扩增吗？...

CT值太小或者太大都不是很好。鉴定你的引物的扩增效率到底怎么样需要模板量在一定范围内来做。
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14楼2013-03-02 04:37:29
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-02 04:37:29
CT值太小或者太大都不是很好。鉴定你的引物的扩增效率到底怎么样需要模板量在一定范围内来做。...

哦哦，明白了。
真的非常感谢您的热心指导！！
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15楼2013-03-02 10:31:58
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qishimi

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
怎么算扩增效率 谢谢啦
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16楼2013-11-24 10:19:29
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by qishimi at 2013-11-24 10:19:29
怎么算扩增效率 谢谢啦

软件自己给出的哦。不过也可以用EXCEL算，具体公式可以网上搜下很多的
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17楼2013-11-28 11:11:12
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lily07007

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
做标准曲线至少需要5个梯度稀释，少于5个标准曲线的扩增效率偏差会很大的
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18楼2014-03-13 10:25:41
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fcx3957946

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
您好：
    想咨询一些关于QPCR扩增效率怎么做的问题？
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19楼2014-05-02 12:43:25
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gengkan

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
两次的实验好像线性相关性都不太好，是不是操作上重复性不好，溶解曲线还不错。
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20楼2015-04-24 09:49:02
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WHABnew

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
建议做了RT之后可以再做PCR，提高模板浓度
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21楼2015-04-24 10:31:17
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