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shiliyusly

新虫 (小有名气)


[交流] QPCR扩增效率太低

大家好,我做QPCR基因扩增效率的时候,一个基因由于CT太大,所以只进行4个2倍的稀释度,二步法退火温度是61度扩增效率不高只有78%(图1)溶解曲线(图3),所以我做了三步法退火温度59度扩增效率反而更低了只有57%(图2)溶解曲线(图4),很奇怪,请教下大家看这是什么原因,该怎么改进呢?有看到资料说把引物浓度提高,不知道效果怎样。

图1.jpg



图2.jpg



图3.jpg



图4.jpg
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wqj1988926

金虫 (正式写手)



shiliyusly(金币+1): 谢谢参与
应该是引物不合适
2楼2013-02-27 09:40:24
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chenyuqin

新虫 (小有名气)



shiliyusly(金币+1): 谢谢参与
分析一下你的基因,拷贝数怎么样,可以增加循环数
3楼2013-02-27 12:57:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)



shiliyusly(金币+1): 谢谢参与
基因丰度不够,CT数太大造成的。如果样品的CT值过高定量也不准确。你可以试试加大模板用量,或者逆转录时在反应体系中加入目的基因特异性3'引物。

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4楼2013-02-27 13:27:56
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shiliyusly

新虫 (小有名气)


引用回帖:
2楼: Originally posted by wqj1988926 at 2013-02-27 09:40:24
应该是引物不合适

谢谢你!溶解曲线也没看到二聚体或者非特异性扩增等,怎么判断是引物不合适呢?不过这个基因表达丰度本来就是很低的。如果要换引物该怎么改进呢?
5楼2013-02-27 16:12:12
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shiliyusly

新虫 (小有名气)


引用回帖:
3楼: Originally posted by chenyuqin at 2013-02-27 12:57:32
分析一下你的基因,拷贝数怎么样,可以增加循环数

谢谢你,最大浓度CT值34了,循环数40个,样品测的CT值也是30多
6楼2013-02-27 16:14:04
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shiliyusly

新虫 (小有名气)


送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-27 13:27:56
基因丰度不够,CT数太大造成的。如果样品的CT值过高定量也不准确。你可以试试加大模板用量,或者逆转录时在反应体系中加入目的基因特异性3'引物。

非常感谢您!这个基因的确丰度很低,如果加大模板用量的话,我的内标基因也得加大了哦,因为我最终要与内标比的,不知道这样会不会又影响内标基因的扩增效率了
7楼2013-02-27 16:19:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-02-28 10:37:45
引用回帖:
7楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-02-27 16:19:05
非常感谢您!这个基因的确丰度很低,如果加大模板用量的话,我的内标基因也得加大了哦,因为我最终要与内标比的,不知道这样会不会又影响内标基因的扩增效率了...

遇到这种情况我有两个做法。一个是PCR时内标与丰度低的基因用不同量模板,使它们的CT值在20-30,计算的时候能够把模板用量差别算进去。丰度实在差别太大的话,反转录时引入低丰度基因特异引物提高其反转录效率,但是这样做引入的差别是无法计算回去的。如果你要做不同样品的相对表达,第二种做法也是可以的,只是无法衡量基因表达的绝对丰度。

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8楼2013-02-28 06:43:53
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shiliyusly

新虫 (小有名气)


送鲜花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-28 06:43:53
遇到这种情况我有两个做法。一个是PCR时内标与丰度低的基因用不同量模板,使它们的CT值在20-30,计算的时候能够把模板用量差别算进去。丰度实在差别太大的话,反转录时引入低丰度基因特异引物提高其反转录效率,但 ...

你说的第一种方法,可不可以这样理解如果丰度低的引物用2倍的模板,内标不变,他们的CT值都在20-30,计算相对表达的时候,将丰度低的基因的CT值减半后再与内标基因进行计算呢?
9楼2013-02-28 07:45:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-02-28 10:37:58
引用回帖:
9楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-02-28 07:45:44
你说的第一种方法,可不可以这样理解如果丰度低的引物用2倍的模板,内标不变,他们的CT值都在20-30,计算相对表达的时候,将丰度低的基因的CT值减半后再与内标基因进行计算呢?...

模板浓度2倍,CT值为原模板浓度的CT-1。所以把2倍浓度的样品的CT+1就可以了。这种做法用于微调。我说的第二种做法是因为丰度实在相差非常多,第一种做法也很难达到预期效果时用的。
10楼2013-02-28 09:14:27
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shiliyusly

新虫 (小有名气)


引用回帖:
10楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-28 09:14:27
模板浓度2倍,CT值为原模板浓度的CT-1。所以把2倍浓度的样品的CT+1就可以了。这种做法用于微调。我说的第二种做法是因为丰度实在相差非常多,第一种做法也很难达到预期效果时用的。...

刚才我把这个基因做扩增效率的4个浓度中最小浓度去掉了(CT值39),就剩了3个浓度的扩增效率有102%了,溶解曲线图和扩增效率曲线如下图:

A8NV9Y92791ETS2])((LB`G.jpg



(DVP632Y0]JBHW){}E`_H8H.jpg



5HJGZ@W7$A~7[W~W)KHNO5J.jpg
但是我用相同方法把相同浓度梯度,三步法和退火温度低2度反应的最低浓度去掉后,扩增效率只有73%,不是应该更大吗?你看我上面得到的102%可信吗?我平时做的杨梅这个基因CT是36左右。

[ Last edited by shiliyusly on 2013-2-28 at 15:53 ]
11楼2013-02-28 15:47:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


引用回帖:
11楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-02-28 15:47:52
刚才我把这个基因做扩增效率的4个浓度中最小浓度去掉了(CT值39),就剩了3个浓度的扩增效率有102%了,溶解曲线图和扩增效率曲线如下图:

A8NV9Y92791ETS2])((LB`G.jpg



(DVP632Y0]JBHW){}E`_H8H.jp ...

CT值在35以上的一般不要用,尽量弄在30以下,实在不行的话33以下。模板浓度很稀的情况,PCR的效率无法接近100%,也就是说增加一个循环,产物浓度不是原来的2倍。
12楼2013-03-01 00:37:22
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shiliyusly

新虫 (小有名气)


引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-01 00:37:22
CT值在35以上的一般不要用,尽量弄在30以下,实在不行的话33以下。模板浓度很稀的情况,PCR的效率无法接近100%,也就是说增加一个循环,产物浓度不是原来的2倍。...

那这个102%扩增效率数据说明不了是好的扩增吗?
13楼2013-03-01 12:22:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


★ ★ ★ ★ ★
shiliyusly: 金币+5 2013-03-02 10:31:26
引用回帖:
13楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-03-01 12:22:54
那这个102%扩增效率数据说明不了是好的扩增吗?...

CT值太小或者太大都不是很好。鉴定你的引物的扩增效率到底怎么样需要模板量在一定范围内来做。
14楼2013-03-02 04:37:29
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shiliyusly

新虫 (小有名气)


引用回帖:
14楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-02 04:37:29
CT值太小或者太大都不是很好。鉴定你的引物的扩增效率到底怎么样需要模板量在一定范围内来做。...

哦哦,明白了。
真的非常感谢您的热心指导!!
15楼2013-03-02 10:31:58
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qishimi

新虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
怎么算扩增效率 谢谢啦
16楼2013-11-24 10:19:29
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shiliyusly

新虫 (小有名气)


引用回帖:
16楼: Originally posted by qishimi at 2013-11-24 10:19:29
怎么算扩增效率 谢谢啦

软件自己给出的哦。不过也可以用EXCEL算,具体公式可以网上搜下很多的
17楼2013-11-28 11:11:12
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lily07007

新虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
做标准曲线至少需要5个梯度稀释,少于5个标准曲线的扩增效率偏差会很大的
18楼2014-03-13 10:25:41
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fcx3957946

新虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
您好:
    想咨询一些关于QPCR扩增效率怎么做的问题?
19楼2014-05-02 12:43:25
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gengkan

木虫 (正式写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
两次的实验好像线性相关性都不太好,是不是操作上重复性不好,溶解曲线还不错。
20楼2015-04-24 09:49:02
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WHABnew

新虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
建议做了RT之后可以再做PCR,提高模板浓度
21楼2015-04-24 10:31:17
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