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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » QPCR扩增效率太低
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shiliyusly

新虫 (小有名气)

[交流] QPCR扩增效率太低

大家好，我做QPCR基因扩增效率的时候，一个基因由于CT太大，所以只进行4个2倍的稀释度，二步法退火温度是61度扩增效率不高只有78%（图1）溶解曲线（图3），所以我做了三步法退火温度59度扩增效率反而更低了只有57%（图2）溶解曲线（图4），很奇怪，请教下大家看这是什么原因，该怎么改进呢？有看到资料说把引物浓度提高，不知道效果怎样。

图1.jpg



图2.jpg



图3.jpg



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1楼 2013-02-26 23:05:23
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-02-28 10:37:45
引用回帖:
7楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-02-27 16:19:05
非常感谢您！这个基因的确丰度很低，如果加大模板用量的话，我的内标基因也得加大了哦，因为我最终要与内标比的，不知道这样会不会又影响内标基因的扩增效率了...

遇到这种情况我有两个做法。一个是PCR时内标与丰度低的基因用不同量模板，使它们的CT值在20-30，计算的时候能够把模板用量差别算进去。丰度实在差别太大的话，反转录时引入低丰度基因特异引物提高其反转录效率，但是这样做引入的差别是无法计算回去的。如果你要做不同样品的相对表达，第二种做法也是可以的，只是无法衡量基因表达的绝对丰度。
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shiliyusly
8楼2013-02-28 06:43:53
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
★
shiliyusly(金币+1): 谢谢参与
应该是引物不合适
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2楼2013-02-27 09:40:24
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chenyuqin

新虫 (小有名气)
★
shiliyusly(金币+1): 谢谢参与
分析一下你的基因，拷贝数怎么样，可以增加循环数
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3楼2013-02-27 12:57:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
shiliyusly(金币+1): 谢谢参与
基因丰度不够，CT数太大造成的。如果样品的CT值过高定量也不准确。你可以试试加大模板用量，或者逆转录时在反应体系中加入目的基因特异性3'引物。
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shiliyusly
4楼2013-02-27 13:27:56
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