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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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Poyno

铜虫 (小有名气)

[求助] 着急!RT-PCR扩增效率低,情况很诡异,求助高手帮忙指点

本人最近在做白色脂肪组织的基因表达,遇到一个很难解决的问题,不知如何解决,也不知问题出在哪里,希望高手帮忙指点!
提取的RNA反转后测定了β-actin和GAPDH,表达量和线性都良好,可是在开始测定18s、PPARγ等其它基因是就出现了扩增效率只能达到50-60%的情况,于是重新做了混标,稀释了标准品,测定后发现扩增效率上去了,接近100%。可是,就是这个已经验证没有问题的标准品,今天再重新做基因表达的时候,扩增效率又只有50-60%了,不知道问题出在哪里?PS:引物,SYBR,程序都没有变换过,应该不是这些因素的问题。个人怀疑是引入了干扰物质,是不是有这种可能,有没有高人也遇到过这种问题?可能的干扰物质有哪一些呢?
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wcg129

禁虫 (著名写手)

感谢参与,应助指数 +1
本帖内容被屏蔽

12楼2012-06-21 09:30:38
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普通回帖
2楼2012-06-18 21:39:35
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-06-19 13:42:04
做个NTC,看体系是否有污染;换荧光,换成热启动酶的荧光,感觉不太可能是体系的原因
3楼2012-06-18 21:41:18
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Poyno

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-06-18 21:41:18
做个NTC,看体系是否有污染;换荧光,换成热启动酶的荧光,感觉不太可能是体系的原因

应该不是体系的问题,因为要做的基因以前已经测过肝脏组织内的表达量,没有任何问题,但是换成了脂肪组织就这个样子了,很诡异的是前几个基因丝毫没有问题,做着做着就出现问题了。请问做个NTC能说明什么问题呢?看看有没有基因组污染?
4楼2012-06-18 21:48:09
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Poyno

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by leguminosae at 2012-06-18 21:39:35

你也遇到过这种情况?请问是怎么解决的呢?
5楼2012-06-18 21:48:28
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 辛苦 2012-06-19 13:42:27
引用回帖:
5楼: Originally posted by Poyno at 2012-06-18 21:48:28
你也遇到过这种情况?请问是怎么解决的呢?...

我遇到过,NTC,没有模板,测的是你体系中引物有没有二聚体或者气溶胶污染。我没做过绝对定量,做的相对定量用普通taq酶效率不高,换成热启动酶就好多了
6楼2012-06-18 21:53:09
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Poyno

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-06-18 21:53:09
我遇到过,NTC,没有模板,测的是你体系中引物有没有二聚体或者气溶胶污染。我没做过绝对定量,做的相对定量用普通taq酶效率不高,换成热启动酶就好多了...

我做的是RT-qPCR,不是普通PCR
7楼2012-06-19 20:09:45
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by Poyno at 2012-06-19 20:09:45
我做的是RT-qPCR,不是普通PCR...

对啊,荧光定量PCR也有热启动酶和普通的mix之分啊
8楼2012-06-19 20:54:34
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l_h_10

金虫 (小有名气)

请问你的这个扩增效率是怎么算的?
我做过的扩增效率都是根据标准曲线算出来的,只要你选定了标准曲线,软件就自动给你算出了扩增效率的。只要引物没有问题,标准曲线稀释的好,基本不会差很多的。
9楼2012-06-19 23:46:24
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Poyno

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by l_h_10 at 2012-06-19 23:46:24
请问你的这个扩增效率是怎么算的?
我做过的扩增效率都是根据标准曲线算出来的,只要你选定了标准曲线,软件就自动给你算出了扩增效率的。只要引物没有问题,标准曲线稀释的好,基本不会差很多的。

就是软件自动计算出来的,所以情况很诡异,重复了很多次,新拿出来的模板没有问题,只要在4度放置一段时间就不行了。本来以为是DNAase污染,可是实验用水,枪头都灭过菌以后还是不行,真心搞不清楚问题出在哪里
10楼2012-06-20 12:51:15
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