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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】RT-PCR不成功
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linxi8579

铜虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】RT-PCR不成功 已有12人参与

最近想做真菌里一个基因的异源表达，可是反转出来的CDNA老是扩不出带来，DNA为模板的能够扩出来。但是用tublin（100多bp）引物扩CDNA能扩出来。我的目的基因大小在3000多bp，高手指点一下吧!
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1楼 2010-08-02 20:29:09
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louli

铜虫 (小有名气)
★ ★
scelab(金币+2):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-08-02 22:49:03
linxi8579(金币+2): 2010-08-03 10:31:46
RNA浓度的问题，可能RNA浓度低 ，你用什么方法提的RNA 啊，最后用多少水溶啊，沉淀多吗？
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2楼2010-08-02 21:11:01
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
linxi8579(金币+1): 2010-08-03 10:31:54
你是要扩完整的阅读框吗？
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3楼2010-08-02 22:24:12
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-03 05:53:15
linxi8579(金币+1): 2010-08-03 10:34:55
恩  建议你上传一下你提的RNA让大家看看！
理论上从cDNA上要比从基因组中好扩增的啊！
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-08-03 00:34:38
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by louli at 2010-08-02 21:11:01:
RNA浓度的问题，可能RNA浓度低 ，你用什么方法提的RNA 啊，最后用多少水溶啊，沉淀多吗？

我是用invitrogen的trizol提的，用TAKARA的DNA酶I消化，然后用trizol再提一遍。不过确实我的RNA浓度很低，以前都是2000多ug/ml，这次才600多。但是我反转加了3ul呢，用天根的MLV反的。我在想除了RNA浓度低，是不是我用trizol提的第二遍有些有机分子影响了反转啊。
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5楼2010-08-03 10:29:49
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-08-02 22:24:12:
你是要扩完整的阅读框吗？

是的，我要做异源表达的。所以从起始扩到终止密码子呢。
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6楼2010-08-03 10:30:52
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-08-03 00:34:38:
恩  建议你上传一下你提的RNA让大家看看！
理论上从cDNA上要比从基因组中好扩增的啊！

我还不太会在这上面传图，嘿嘿。不过我的胶图因为我测的RNA浓度600多ug/ml，有点低所以我加了2.5ul上样，结果有点过了。但是5S带还有，我看还行吧。
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7楼2010-08-03 10:34:46
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ymzfeng

金虫 (小有名气)
以cDNA为模板进行扩增
还要优化你的反应体系和反应条件
循环数是否适宜
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8楼2010-08-03 10:40:37
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huking

铁虫 (小有名气)
退火温度设一个梯度，模板也可以设置一梯度，另外延伸时间设置长一些，看你的片段挺大的。
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9楼2010-08-03 10:54:58
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kimxu_nt

木虫 (著名写手)
1000bp以上做PCR不仅困难，错配几率也增加了啊
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10楼2010-08-03 11:21:42
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