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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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linxi8579

铜虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】RT-PCR不成功 已有12人参与

最近想做真菌里一个基因的异源表达,可是反转出来的CDNA老是扩不出带来,DNA为模板的能够扩出来。但是用tublin(100多bp)引物扩CDNA能扩出来。我的目的基因大小在3000多bp,高手指点一下吧!
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louli

铜虫 (小有名气)

★ ★
scelab(金币+2):热心虫友,欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-08-02 22:49:03
linxi8579(金币+2): 2010-08-03 10:31:46
RNA浓度的问题,可能RNA浓度低 ,你用什么方法提的RNA 啊,最后用多少水溶啊,沉淀多吗?
2楼2010-08-02 21:11:01
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

linxi8579(金币+1): 2010-08-03 10:31:54
你是要扩完整的阅读框吗?
3楼2010-08-02 22:24:12
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主

★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-03 05:53:15
linxi8579(金币+1): 2010-08-03 10:34:55
恩  建议你上传一下你提的RNA让大家看看!
理论上从cDNA上要比从基因组中好扩增的啊!
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-08-03 00:34:38
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linxi8579

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by louli at 2010-08-02 21:11:01:
RNA浓度的问题,可能RNA浓度低 ,你用什么方法提的RNA 啊,最后用多少水溶啊,沉淀多吗?

我是用invitrogen的trizol提的,用TAKARA的DNA酶I消化,然后用trizol再提一遍。不过确实我的RNA浓度很低,以前都是2000多ug/ml,这次才600多。但是我反转加了3ul呢,用天根的MLV反的。我在想除了RNA浓度低,是不是我用trizol提的第二遍有些有机分子影响了反转啊。
5楼2010-08-03 10:29:49
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linxi8579

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-08-02 22:24:12:
你是要扩完整的阅读框吗?

是的,我要做异源表达的。所以从起始扩到终止密码子呢。
6楼2010-08-03 10:30:52
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linxi8579

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-08-03 00:34:38:
恩  建议你上传一下你提的RNA让大家看看!
理论上从cDNA上要比从基因组中好扩增的啊!

我还不太会在这上面传图,嘿嘿。不过我的胶图因为我测的RNA浓度600多ug/ml,有点低所以我加了2.5ul上样,结果有点过了。但是5S带还有,我看还行吧。
7楼2010-08-03 10:34:46
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ymzfeng

金虫 (小有名气)

以cDNA为模板进行扩增
还要优化你的反应体系和反应条件
循环数是否适宜
8楼2010-08-03 10:40:37
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huking

铁虫 (小有名气)

退火温度设一个梯度,模板也可以设置一梯度,另外延伸时间设置长一些,看你的片段挺大的。
9楼2010-08-03 10:54:58
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kimxu_nt

木虫 (著名写手)

1000bp以上做PCR不仅困难,错配几率也增加了啊
10楼2010-08-03 11:21:42
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