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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】RT-PCR不成功
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305554991

新虫 (初入文坛)
我也碰过，后来换了一个试剂盒就好了，试试TOYOBO的反转录试剂盒50次的600元。
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21楼2010-08-04 17:13:35
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by shuiyue2728 at 2010-08-04 17:03:51:



cDNA里这个基因的富集度不高，引物特异性体系和条件是很重要的

请问您有什么好的建议吗？
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22楼2010-08-07 20:12:21
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zzp55zzp

新虫 (初入文坛)
首先，你要验证引物适用性和最佳的退火温度，验引物适用性，先用软件测试吧，再用阳性质粒中做温度梯度，确定最佳退火温度，这个对你最后的方法验证也是很有必须的。然后验证转录出cDNA质量和浓度。有没有转录出cDNA？目的片段是否完整？这两个问题解决了，最后做方法验证，这样你的实验结果才是可靠并且可重复的。
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23楼2010-08-09 10:41:39
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cpu2004

金虫 (小有名气)
linxi8579(金币+2): 2010-08-11 10:13:58
可能逆转录达不到你的长度，MLV受RNA二级结构的影响相对大一些，虽然MLV扩增长度更长但是打开二级结构的能力不如AMV，AMV逆转3kd也是足够了，你可以试试。
另外你设计一个到你polyA端大概在500bp左右的特异性上游引物，和你的下游引物做一次PCR，如果它能P出来说明肯定是逆转录达不到你要的长度。
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24楼2010-08-09 11:11:22
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shuiyue2728

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by linxi8579 at 2010-08-07 20:12:21:

请问您有什么好的建议吗？

引物就是之前说过的，提高所提取RNA的质量
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25楼2010-08-10 13:11:16
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by cpu2004 at 2010-08-09 11:11:22:
可能逆转录达不到你的长度，MLV受RNA二级结构的影响相对大一些，虽然MLV扩增长度更长但是打开二级结构的能力不如AMV，AMV逆转3kd也是足够了，你可以试试。
另外你设计一个到你polyA端大概在500bp左右的特异性上游 ...

恩，谢谢你啦。
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26楼2010-08-11 10:14:21
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