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305554991

新虫 (初入文坛)

我也碰过,后来换了一个试剂盒就好了,试试TOYOBO的反转录试剂盒50次的600元。
21楼2010-08-04 17:13:35
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linxi8579

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by shuiyue2728 at 2010-08-04 17:03:51:



cDNA里这个基因的富集度不高,引物特异性体系和条件是很重要的

请问您有什么好的建议吗?
22楼2010-08-07 20:12:21
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zzp55zzp

新虫 (初入文坛)

首先,你要验证引物适用性和最佳的退火温度,验引物适用性,先用软件测试吧,再用阳性质粒中做温度梯度,确定最佳退火温度,这个对你最后的方法验证也是很有必须的。然后验证转录出cDNA质量和浓度。有没有转录出cDNA?目的片段是否完整?这两个问题解决了,最后做方法验证,这样你的实验结果才是可靠并且可重复的。
23楼2010-08-09 10:41:39
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cpu2004

金虫 (小有名气)

linxi8579(金币+2): 2010-08-11 10:13:58
可能逆转录达不到你的长度,MLV受RNA二级结构的影响相对大一些,虽然MLV扩增长度更长但是打开二级结构的能力不如AMV,AMV逆转3kd也是足够了,你可以试试。
另外你设计一个到你polyA端大概在500bp左右的特异性上游引物,和你的下游引物做一次PCR,如果它能P出来说明肯定是逆转录达不到你要的长度。
24楼2010-08-09 11:11:22
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shuiyue2728

新虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by linxi8579 at 2010-08-07 20:12:21:

请问您有什么好的建议吗?

引物就是之前说过的,提高所提取RNA的质量
25楼2010-08-10 13:11:16
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linxi8579

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by cpu2004 at 2010-08-09 11:11:22:
可能逆转录达不到你的长度,MLV受RNA二级结构的影响相对大一些,虽然MLV扩增长度更长但是打开二级结构的能力不如AMV,AMV逆转3kd也是足够了,你可以试试。
另外你设计一个到你polyA端大概在500bp左右的特异性上游 ...

恩,谢谢你啦。
26楼2010-08-11 10:14:21
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