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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】RT-PCR不成功
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linxi8579

铜虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】RT-PCR不成功 已有12人参与

最近想做真菌里一个基因的异源表达，可是反转出来的CDNA老是扩不出带来，DNA为模板的能够扩出来。但是用tublin（100多bp）引物扩CDNA能扩出来。我的目的基因大小在3000多bp，高手指点一下吧!
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1楼 2010-08-02 20:29:09
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cpu2004

金虫 (小有名气)
linxi8579(金币+2): 2010-08-11 10:13:58
可能逆转录达不到你的长度，MLV受RNA二级结构的影响相对大一些，虽然MLV扩增长度更长但是打开二级结构的能力不如AMV，AMV逆转3kd也是足够了，你可以试试。
另外你设计一个到你polyA端大概在500bp左右的特异性上游引物，和你的下游引物做一次PCR，如果它能P出来说明肯定是逆转录达不到你要的长度。
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24楼2010-08-09 11:11:22
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louli

铜虫 (小有名气)
★ ★
scelab(金币+2):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-08-02 22:49:03
linxi8579(金币+2): 2010-08-03 10:31:46
RNA浓度的问题，可能RNA浓度低 ，你用什么方法提的RNA 啊，最后用多少水溶啊，沉淀多吗？
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2楼2010-08-02 21:11:01
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
linxi8579(金币+1): 2010-08-03 10:31:54
你是要扩完整的阅读框吗？
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3楼2010-08-02 22:24:12
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-03 05:53:15
linxi8579(金币+1): 2010-08-03 10:34:55
恩  建议你上传一下你提的RNA让大家看看！
理论上从cDNA上要比从基因组中好扩增的啊！
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-08-03 00:34:38
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