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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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houhoujiayou

银虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】做过RT-PCR的请进

大家好,我因为新近才换课题,要提mRNA做反转录,因为实验室没有人做过,不知道试验中应该注意什么,还有都要用到什么试剂盒什么酶?请做过的人降一下我也好让老师早点买试剂盒和酶啊,先谢谢了啊。
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nininini

银虫 (小有名气)


★ ★
houhoujiayou(金币+5): 谢谢MM了,但是不是很明白,要DNase消化是为什么啊?另外为什么说“只做反转录”啊,还有其他的操作目的吗?我是要把酵母的基因反P出来后做表达的啊,MM做过的话可以说的详细点吗?谢谢了啊 2011-03-14 09:16:09
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-03-14 09:26:11
如果是只做反转录的话只需要提取RNA、DNase消化和反转录酶了,根据实验室情况RNA提取可以用试剂盒也可以用其它试剂提取,DNase和反转录酶也都差不多了,找平时经常使用试剂的厂家应该问题不大了吧,天根、生工什么的应该都没问题吧
2楼2011-03-14 09:08:21
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weishengsu5

木虫 (正式写手)


houhoujiayou(金币+3): 这个我听说过了,说要用什么溶液把所有要用的仪器泡一下,那基本上要买什么试剂盒和酶啊,能把操作步骤详细讲一下嘛?虽然看过理论,可是实际做起来还是无从下手,咳 2011-03-14 09:25:30
引用回帖:
Originally posted by houhoujiayou at 2011-03-14 09:01:37:
大家好,我因为新近才换课题,要提mRNA做反转录,因为实验室没有人做过,不知道试验中应该注意什么,还有都要用到什么试剂盒什么酶?请做过的人降一下我也好让老师早点买试剂盒和酶啊,先谢谢了啊。

在提取mRNA中注意他是很容易降解的,自然环境中都存在着核酸酶,所以提取过程中注意下
3楼2011-03-14 09:17:55
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weishengsu5

木虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by nininini at 2011-03-14 09:08:21:
如果是只做反转录的话只需要提取RNA、DNase消化和反转录酶了,根据实验室情况RNA提取可以用试剂盒也可以用其它试剂提取,DNase和反转录酶也都差不多了,找平时经常使用试剂的厂家应该问题不大了吧,天根、生工什么 ...

你是研究什么代谢的,我们课题组也是代谢方向的
4楼2011-03-14 09:22:28
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houhoujiayou

银虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by weishengsu5 at 2011-03-14 09:22:28:
你是研究什么代谢的,我们课题组也是代谢方向的

我是做一个基因的克隆表达,之前的课题做不出来,临时换了一个,具体怎么操作我都不明白,急啊
5楼2011-03-14 09:27:22
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jiangzhiang

铁杆木虫 (正式写手)


houhoujiayou(金币+1): 嗯哪,谢谢了啊,我再看看操作书吧 2011-03-14 10:05:35
houhoujiayou(金币+1): 2011-03-16 12:01:17
还是没明白,是从来没接触过,还是试验遇到困难,实在不知道怎么办先看看分子克隆手册,或者别人的论文,熟悉下流程,需要什么试剂好说吧,我觉得MBI和TAKALA的不错
6楼2011-03-14 09:51:19
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zhaoxianfeng

金虫 (初入文坛)



silicare(金币+1): 谢谢参与 2011-03-14 11:50:57
houhoujiayou(金币+1): 2011-03-16 12:01:22
引用回帖:
Originally posted by houhoujiayou at 2011-03-14 09:01:37:
大家好,我因为新近才换课题,要提mRNA做反转录,因为实验室没有人做过,不知道试验中应该注意什么,还有都要用到什么试剂盒什么酶?请做过的人降一下我也好让老师早点买试剂盒和酶啊,先谢谢了啊。

1.提RNA,防降解
2.rt,反转RNA得出cDNA
3.用cDNA做模板进行PCR,我们用宝生物的试剂盒做的
4.1%电泳检测,照相。
7楼2011-03-14 10:37:22
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)


houhoujiayou(金币+1): 2011-03-16 12:01:25
这个先得把分子克隆实验指导看一遍(相关方面),那样会比较全面,如果实验中遇到问题,来这里求助会比较好,祝实验顺利!
8楼2011-03-14 11:35:14
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没有眼泪

铜虫 (初入文坛)


houhoujiayou(金币+1): 2011-03-16 12:01:28
1.提取总RNA,跑胶看一下质量
2.RT-PCR,一般用Olig-dT转录出cDNA(我们用的是东洋舫的盒子)
再进行后续实验
9楼2011-03-14 14:39:41
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tingspdf

至尊木虫 (著名写手)


houhoujiayou(金币+1): 2011-03-16 12:01:32
看分子克隆吧,那上面是最全的
10楼2011-03-14 16:00:41
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nininini

银虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by weishengsu5 at 2011-03-14 09:22:28:
你是研究什么代谢的,我们课题组也是代谢方向的

我们也差不多啦~
11楼2011-03-15 17:28:39
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nininini

银虫 (小有名气)


houhoujiayou(金币+1): 谢谢 2011-03-22 20:57:24
引用回帖:
Originally posted by nininini at 2011-03-14 09:08:21:
如果是只做反转录的话只需要提取RNA、DNase消化和反转录酶了,根据实验室情况RNA提取可以用试剂盒也可以用其它试剂提取,DNase和反转录酶也都差不多了,找平时经常使用试剂的厂家应该问题不大了吧,天根、生工什么 ...

DNase的目的是进一步消化未完全除尽的DNA,如果只是表达的话不用定量之类的相对要求低一点儿,只要能P出产物就好了~
12楼2011-03-15 17:31:53
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mxlo.o

金虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by 没有眼泪 at 2011-03-14 14:39:41:
1.提取总RNA,跑胶看一下质量
2.RT-PCR,一般用Olig-dT转录出cDNA(我们用的是东洋舫的盒子)
再进行后续实验

我用一种真菌提取出RNA后进行了反转录,其中1kb左右的片段提取出来了,但是2kb左右的片段怎么也扩增不出来。我的问题是1kb的能扩出来是否证明我提取的RNA没有问题,如果这样的话,哪2kb的为什么扩增不出来?
13楼2011-12-09 22:19:44
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