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houhoujiayou

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】做过RT-PCR的请进

大家好，我因为新近才换课题，要提mRNA做反转录，因为实验室没有人做过，不知道试验中应该注意什么，还有都要用到什么试剂盒什么酶？请做过的人降一下我也好让老师早点买试剂盒和酶啊，先谢谢了啊。
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1楼 2011-03-14 09:01:37
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nininini

银虫 (小有名气)
★ ★
houhoujiayou(金币+5): 谢谢MM了，但是不是很明白，要DNase消化是为什么啊？另外为什么说“只做反转录”啊，还有其他的操作目的吗？我是要把酵母的基因反P出来后做表达的啊，MM做过的话可以说的详细点吗？谢谢了啊 2011-03-14 09:16:09
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-03-14 09:26:11
如果是只做反转录的话只需要提取RNA、DNase消化和反转录酶了，根据实验室情况RNA提取可以用试剂盒也可以用其它试剂提取，DNase和反转录酶也都差不多了，找平时经常使用试剂的厂家应该问题不大了吧，天根、生工什么的应该都没问题吧
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2楼2011-03-14 09:08:21
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weishengsu5

木虫 (正式写手)
houhoujiayou(金币+3): 这个我听说过了，说要用什么溶液把所有要用的仪器泡一下，那基本上要买什么试剂盒和酶啊，能把操作步骤详细讲一下嘛？虽然看过理论，可是实际做起来还是无从下手，咳 2011-03-14 09:25:30
引用回帖:
Originally posted by houhoujiayou at 2011-03-14 09:01:37:
大家好，我因为新近才换课题，要提mRNA做反转录，因为实验室没有人做过，不知道试验中应该注意什么，还有都要用到什么试剂盒什么酶？请做过的人降一下我也好让老师早点买试剂盒和酶啊，先谢谢了啊。

在提取mRNA中注意他是很容易降解的，自然环境中都存在着核酸酶，所以提取过程中注意下
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3楼2011-03-14 09:17:55
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weishengsu5

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by nininini at 2011-03-14 09:08:21:
如果是只做反转录的话只需要提取RNA、DNase消化和反转录酶了，根据实验室情况RNA提取可以用试剂盒也可以用其它试剂提取，DNase和反转录酶也都差不多了，找平时经常使用试剂的厂家应该问题不大了吧，天根、生工什么 ...

你是研究什么代谢的，我们课题组也是代谢方向的
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4楼2011-03-14 09:22:28
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houhoujiayou

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by weishengsu5 at 2011-03-14 09:22:28:
你是研究什么代谢的，我们课题组也是代谢方向的

我是做一个基因的克隆表达，之前的课题做不出来，临时换了一个，具体怎么操作我都不明白，急啊
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5楼2011-03-14 09:27:22
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jiangzhiang

铁杆木虫 (正式写手)
houhoujiayou(金币+1): 嗯哪，谢谢了啊，我再看看操作书吧 2011-03-14 10:05:35
houhoujiayou(金币+1): 2011-03-16 12:01:17
还是没明白，是从来没接触过，还是试验遇到困难，实在不知道怎么办先看看分子克隆手册，或者别人的论文，熟悉下流程，需要什么试剂好说吧，我觉得MBI和TAKALA的不错
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6楼2011-03-14 09:51:19
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zhaoxianfeng

金虫 (初入文坛)
★
silicare(金币+1): 谢谢参与 2011-03-14 11:50:57
houhoujiayou(金币+1): 2011-03-16 12:01:22
引用回帖:
Originally posted by houhoujiayou at 2011-03-14 09:01:37:
大家好，我因为新近才换课题，要提mRNA做反转录，因为实验室没有人做过，不知道试验中应该注意什么，还有都要用到什么试剂盒什么酶？请做过的人降一下我也好让老师早点买试剂盒和酶啊，先谢谢了啊。

1.提RNA，防降解
2.rt，反转RNA得出cDNA
3.用cDNA做模板进行PCR，我们用宝生物的试剂盒做的
4.1%电泳检测，照相。
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7楼2011-03-14 10:37:22
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
houhoujiayou(金币+1): 2011-03-16 12:01:25
这个先得把分子克隆实验指导看一遍(相关方面），那样会比较全面，如果实验中遇到问题，来这里求助会比较好，祝实验顺利！
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8楼2011-03-14 11:35:14
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没有眼泪

铜虫 (初入文坛)
houhoujiayou(金币+1): 2011-03-16 12:01:28
1.提取总RNA，跑胶看一下质量
2.RT-PCR，一般用Olig-dT转录出cDNA（我们用的是东洋舫的盒子）
再进行后续实验
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9楼2011-03-14 14:39:41
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tingspdf

至尊木虫 (著名写手)
houhoujiayou(金币+1): 2011-03-16 12:01:32
看分子克隆吧，那上面是最全的
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10楼2011-03-14 16:00:41
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nininini

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by weishengsu5 at 2011-03-14 09:22:28:
你是研究什么代谢的，我们课题组也是代谢方向的

我们也差不多啦~
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11楼2011-03-15 17:28:39
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nininini

银虫 (小有名气)
houhoujiayou(金币+1): 谢谢 2011-03-22 20:57:24
引用回帖:
Originally posted by nininini at 2011-03-14 09:08:21:
如果是只做反转录的话只需要提取RNA、DNase消化和反转录酶了，根据实验室情况RNA提取可以用试剂盒也可以用其它试剂提取，DNase和反转录酶也都差不多了，找平时经常使用试剂的厂家应该问题不大了吧，天根、生工什么 ...

DNase的目的是进一步消化未完全除尽的DNA，如果只是表达的话不用定量之类的相对要求低一点儿，只要能P出产物就好了~
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12楼2011-03-15 17:31:53
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mxlo.o

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by 没有眼泪 at 2011-03-14 14:39:41:
1.提取总RNA，跑胶看一下质量
2.RT-PCR，一般用Olig-dT转录出cDNA（我们用的是东洋舫的盒子）
再进行后续实验

我用一种真菌提取出RNA后进行了反转录，其中1kb左右的片段提取出来了，但是2kb左右的片段怎么也扩增不出来。我的问题是1kb的能扩出来是否证明我提取的RNA没有问题，如果这样的话，哪2kb的为什么扩增不出来？
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13楼2011-12-09 22:19:44
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