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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 着急！RT-PCR扩增效率低，情况很诡异，求助高手帮忙指点
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Poyno

铜虫 (小有名气)

[求助] 着急！RT-PCR扩增效率低，情况很诡异，求助高手帮忙指点

本人最近在做白色脂肪组织的基因表达，遇到一个很难解决的问题，不知如何解决，也不知问题出在哪里，希望高手帮忙指点！
提取的RNA反转后测定了β-actin和GAPDH，表达量和线性都良好，可是在开始测定18s、PPARγ等其它基因是就出现了扩增效率只能达到50-60%的情况，于是重新做了混标，稀释了标准品，测定后发现扩增效率上去了，接近100%。可是，就是这个已经验证没有问题的标准品，今天再重新做基因表达的时候，扩增效率又只有50-60%了，不知道问题出在哪里？PS：引物，SYBR，程序都没有变换过，应该不是这些因素的问题。个人怀疑是引入了干扰物质，是不是有这种可能，有没有高人也遇到过这种问题？可能的干扰物质有哪一些呢？
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1楼 2012-06-18 20:59:34
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wcg129

禁虫 (著名写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
12楼2012-06-21 09:30:38
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普通回帖

leguminosae
2楼2012-06-18 21:39:35
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-06-19 13:42:04
做个NTC，看体系是否有污染；换荧光，换成热启动酶的荧光，感觉不太可能是体系的原因
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3楼2012-06-18 21:41:18
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Poyno

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-06-18 21:41:18
做个NTC，看体系是否有污染；换荧光，换成热启动酶的荧光，感觉不太可能是体系的原因

应该不是体系的问题，因为要做的基因以前已经测过肝脏组织内的表达量，没有任何问题，但是换成了脂肪组织就这个样子了，很诡异的是前几个基因丝毫没有问题，做着做着就出现问题了。请问做个NTC能说明什么问题呢？看看有没有基因组污染？
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4楼2012-06-18 21:48:09
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Poyno

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by leguminosae at 2012-06-18 21:39:35

你也遇到过这种情况？请问是怎么解决的呢？
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5楼2012-06-18 21:48:28
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 辛苦 2012-06-19 13:42:27
引用回帖:
5楼: Originally posted by Poyno at 2012-06-18 21:48:28
你也遇到过这种情况？请问是怎么解决的呢？...

我遇到过，NTC，没有模板，测的是你体系中引物有没有二聚体或者气溶胶污染。我没做过绝对定量，做的相对定量用普通taq酶效率不高，换成热启动酶就好多了
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6楼2012-06-18 21:53:09
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Poyno

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-06-18 21:53:09
我遇到过，NTC，没有模板，测的是你体系中引物有没有二聚体或者气溶胶污染。我没做过绝对定量，做的相对定量用普通taq酶效率不高，换成热启动酶就好多了...

我做的是RT-qPCR，不是普通PCR
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7楼2012-06-19 20:09:45
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by Poyno at 2012-06-19 20:09:45
我做的是RT-qPCR，不是普通PCR...

对啊，荧光定量PCR也有热启动酶和普通的mix之分啊
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8楼2012-06-19 20:54:34
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l_h_10

金虫 (小有名气)
请问你的这个扩增效率是怎么算的？
我做过的扩增效率都是根据标准曲线算出来的，只要你选定了标准曲线，软件就自动给你算出了扩增效率的。只要引物没有问题，标准曲线稀释的好，基本不会差很多的。
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9楼2012-06-19 23:46:24
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Poyno

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by l_h_10 at 2012-06-19 23:46:24
请问你的这个扩增效率是怎么算的？
我做过的扩增效率都是根据标准曲线算出来的，只要你选定了标准曲线，软件就自动给你算出了扩增效率的。只要引物没有问题，标准曲线稀释的好，基本不会差很多的。

就是软件自动计算出来的，所以情况很诡异，重复了很多次，新拿出来的模板没有问题，只要在4度放置一段时间就不行了。本来以为是DNAase污染，可是实验用水，枪头都灭过菌以后还是不行，真心搞不清楚问题出在哪里
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10楼2012-06-20 12:51:15
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