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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » QPCR扩增效率太低
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shiliyusly

新虫 (小有名气)

[交流] QPCR扩增效率太低

大家好，我做QPCR基因扩增效率的时候，一个基因由于CT太大，所以只进行4个2倍的稀释度，二步法退火温度是61度扩增效率不高只有78%（图1）溶解曲线（图3），所以我做了三步法退火温度59度扩增效率反而更低了只有57%（图2）溶解曲线（图4），很奇怪，请教下大家看这是什么原因，该怎么改进呢？有看到资料说把引物浓度提高，不知道效果怎样。

图1.jpg



图2.jpg



图3.jpg



图4.jpg
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1楼 2013-02-26 23:05:23
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
11楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-02-28 15:47:52
刚才我把这个基因做扩增效率的4个浓度中最小浓度去掉了（CT值39），就剩了3个浓度的扩增效率有102%了，溶解曲线图和扩增效率曲线如下图：

A8NV9Y92791ETS2])((LB`G.jpg



(DVP632Y0]JBHW){}E`_H8H.jp ...

CT值在35以上的一般不要用，尽量弄在30以下，实在不行的话33以下。模板浓度很稀的情况，PCR的效率无法接近100%，也就是说增加一个循环，产物浓度不是原来的2倍。
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12楼2013-03-01 00:37:22
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
★
shiliyusly(金币+1): 谢谢参与
应该是引物不合适
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2楼2013-02-27 09:40:24
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chenyuqin

新虫 (小有名气)
★
shiliyusly(金币+1): 谢谢参与
分析一下你的基因，拷贝数怎么样，可以增加循环数
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3楼2013-02-27 12:57:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
shiliyusly(金币+1): 谢谢参与
基因丰度不够，CT数太大造成的。如果样品的CT值过高定量也不准确。你可以试试加大模板用量，或者逆转录时在反应体系中加入目的基因特异性3'引物。
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shiliyusly
4楼2013-02-27 13:27:56
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