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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 相对定量中怎样提高扩增效率
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天一止水

新虫 (初入文坛)

[求助] 相对定量中怎样提高扩增效率

我现在在做相对定量，做到了确定目的基因和内参基因扩增扩增效率一致这一步，用的是takara的realtime pcr sybr green，目的片段和内参基因片段分别是160和180bp,程序也是takara说明书上的，95  30s, (95 5s ， 60 30s)40个循环，样品是连续稀释5倍的，现在把图片上传给大家看，求助怎样能再提高内参的扩增效率，因为看到两个要都在95%-105%才可以

II5DZ$NWSZ6{@(8ZU]ES(6H.jpg



目的基因溶解曲线.jpg



内参溶解曲线.jpg
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1楼 2012-11-14 08:55:27
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从熔解曲线看是不错的，没有引物二聚体形成。可能是你的目的基因的丰度太低，所以效率上不去，用浓度高一点的模板试试。
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2楼2012-11-14 12:33:28
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天一止水

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-14 12:33:28
从熔解曲线看是不错的，没有引物二聚体形成。可能是你的目的基因的丰度太低，所以效率上不去，用浓度高一点的模板试试。

谢谢指教，上午延长了退火和延伸的时间，从30s延长到60s了，除去两个点后两个的扩增效率分别是93.8和93.2%，相关系数也很好，但是看到论坛里说相对定量扩增效率要达到95-105%，打算再 降低退火温度为59°试试，不知效果怎么样呢。谢谢你
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3楼2012-11-14 14:53:46
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天一止水

新虫 (初入文坛)
wizardfan: 帖子右下角有个评分的键，请给对你有帮助的帖子金币 2012-11-15 08:58:05
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-14 12:33:28
从熔解曲线看是不错的，没有引物二聚体形成。可能是你的目的基因的丰度太低，所以效率上不去，用浓度高一点的模板试试。

对了  我是不是要给你金币啊   怎么弄呢？
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4楼2012-11-14 14:55:48
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berniehuang

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
内参基因应该是表达丰度比较高且相对恒定的，内参基因的扩增效率也不是很好，可能还是引物的问题。多设几个退火温度的梯度，还要务必要保证模板的质量，不要有蛋白或RNA的污染。建议如有文献上能查到引物序列，就直接合成即可；如果查不到，就多合成几对，摸索一下退火温度试试。
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5楼2012-11-15 08:48:21
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 天一止水 at 2012-11-14 14:53:46
谢谢指教，上午延长了退火和延伸的时间，从30s延长到60s了，除去两个点后两个的扩增效率分别是93.8和93.2%，相关系数也很好，但是看到论坛里说相对定量扩增效率要达到95-105%，打算再 降低退火温度为59°试试，不知 ...

引物的退火温度最好做一个梯度摸一下。一般做qPCR的退火温度最好在60°C以上，退火和延伸一步完成。
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6楼2012-11-15 08:53:50
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