应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 相对定量中怎样提高扩增效率
61/1返回列表
查看: 1768  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

天一止水

新虫 (初入文坛)

[求助] 相对定量中怎样提高扩增效率

我现在在做相对定量，做到了确定目的基因和内参基因扩增扩增效率一致这一步，用的是takara的realtime pcr sybr green，目的片段和内参基因片段分别是160和180bp,程序也是takara说明书上的，95  30s, (95 5s ， 60 30s)40个循环，样品是连续稀释5倍的，现在把图片上传给大家看，求助怎样能再提高内参的扩增效率，因为看到两个要都在95%-105%才可以

II5DZ$NWSZ6{@(8ZU]ES(6H.jpg



目的基因溶解曲线.jpg



内参溶解曲线.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2012-11-14 08:55:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从熔解曲线看是不错的，没有引物二聚体形成。可能是你的目的基因的丰度太低，所以效率上不去，用浓度高一点的模板试试。
赞一下 回复此楼
2楼2012-11-14 12:33:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天一止水

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-14 12:33:28
从熔解曲线看是不错的，没有引物二聚体形成。可能是你的目的基因的丰度太低，所以效率上不去，用浓度高一点的模板试试。

谢谢指教，上午延长了退火和延伸的时间，从30s延长到60s了，除去两个点后两个的扩增效率分别是93.8和93.2%，相关系数也很好，但是看到论坛里说相对定量扩增效率要达到95-105%，打算再 降低退火温度为59°试试，不知效果怎么样呢。谢谢你
赞一下 回复此楼
3楼2012-11-14 14:53:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天一止水

新虫 (初入文坛)
wizardfan: 帖子右下角有个评分的键，请给对你有帮助的帖子金币 2012-11-15 08:58:05
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-14 12:33:28
从熔解曲线看是不错的，没有引物二聚体形成。可能是你的目的基因的丰度太低，所以效率上不去，用浓度高一点的模板试试。

对了  我是不是要给你金币啊   怎么弄呢？
赞一下 回复此楼
4楼2012-11-14 14:55:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

berniehuang

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
内参基因应该是表达丰度比较高且相对恒定的，内参基因的扩增效率也不是很好，可能还是引物的问题。多设几个退火温度的梯度，还要务必要保证模板的质量，不要有蛋白或RNA的污染。建议如有文献上能查到引物序列，就直接合成即可；如果查不到，就多合成几对，摸索一下退火温度试试。
赞一下 回复此楼
5楼2012-11-15 08:48:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 天一止水 at 2012-11-14 14:53:46
谢谢指教，上午延长了退火和延伸的时间，从30s延长到60s了，除去两个点后两个的扩增效率分别是93.8和93.2%，相关系数也很好，但是看到论坛里说相对定量扩增效率要达到95-105%，打算再 降低退火温度为59°试试，不知 ...

引物的退火温度最好做一个梯度摸一下。一般做qPCR的退火温度最好在60°C以上，退火和延伸一步完成。
赞一下 回复此楼
6楼2012-11-15 08:53:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 天一止水 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 云南大学材料与能源学院解琳课题组钙钛矿博士招生 +4 光伏爱好者 2026-05-17 7/350 2026-05-24 10:20 by 光伏爱好者
[基金申请] 西安交大新媒学院副院长用撤稿论文结题 +3 bjvtcliu 2026-05-24 5/250 2026-05-24 10:16 by kudofaye
[教师之家] 论文撤稿了 +3 bjvtcliu 2026-05-24 5/250 2026-05-24 10:06 by Equinoxhua
[教师之家] 某211大学教师把个人教师官方主页改成:我跑了我跑了我跑了!官宣跑路！ +4 zju2000 2026-05-21 5/250 2026-05-24 09:35 by songwz
[考博] 26/27申博自荐 10+4 ZXW0202 2026-05-22 9/450 2026-05-24 08:47 by bjvtcliu
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 hvkbtfonbv 2026-05-23 3/150 2026-05-24 08:01 by 9ps9vgkqva
[基金申请] 河北省自然科学基金 +5 Peterchao 2026-05-18 7/350 2026-05-23 16:57 by articlefan
[基金申请] 揭秘青基评审内幕：几个A才能顺利中标 +3 国自然国社科中 2026-05-23 4/200 2026-05-23 15:37 by 2000zf36392
[基金申请] 青B发送上会通知了吗 +5 chemBioBro 2026-05-22 7/350 2026-05-23 12:35 by zhuifengzhy
[考博] 博士申请 +3 焦晓明 2026-05-21 3/150 2026-05-23 11:26 by mlc840311
[论文投稿] 投稿求助，期刊 +4 希冀，有书读 2026-05-20 8/400 2026-05-22 10:16 by 希冀，有书读
[文学芳草园] 献血感触 +7 呀呀好傻 2026-05-19 13/650 2026-05-21 20:15 by 呀呀好傻
[基金申请] 面上本子正文33页，违规吗？会被低分嘛？ +14 1234567wang 2026-05-17 16/800 2026-05-21 17:58 by 脆脆的饼干
[基金申请] 国自然评分 +4 无名者登山 2026-05-20 5/250 2026-05-21 16:35 by swuq
[基金申请] 国自然上会要求 +7 无名者登山 2026-05-18 11/550 2026-05-21 15:50 by draco1987
[基金申请] 提交了我也来说说感想 +9 fummck 2026-05-20 10/500 2026-05-21 14:17 by draco1987
[基金申请] 评审有感 +15 popular289 2026-05-18 26/1300 2026-05-21 10:35 by 西葫芦炒鸡蛋
[有机交流] 反应很差，大量原料没有反应 5+3 Mr.Zot 2026-05-19 8/400 2026-05-20 22:19 by Equinoxhua
[考博] 如果工作了想读博，可以边工作边读全日制嘛？ 30+3 铁达火车 2026-05-18 5/250 2026-05-20 09:33 by tfang
[考博] 博士申请 +5 星…… 2026-05-18 6/300 2026-05-18 23:49 by 糊糊涂涂好
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭