应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 相对定量中怎样提高扩增效率
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
61/1返回列表
查看: 1698  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

天一止水

新虫 (初入文坛)

[求助] 相对定量中怎样提高扩增效率

我现在在做相对定量，做到了确定目的基因和内参基因扩增扩增效率一致这一步，用的是takara的realtime pcr sybr green，目的片段和内参基因片段分别是160和180bp,程序也是takara说明书上的，95  30s, (95 5s ， 60 30s)40个循环，样品是连续稀释5倍的，现在把图片上传给大家看，求助怎样能再提高内参的扩增效率，因为看到两个要都在95%-105%才可以

II5DZ$NWSZ6{@(8ZU]ES(6H.jpg



目的基因溶解曲线.jpg



内参溶解曲线.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2012-11-14 08:55:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从熔解曲线看是不错的，没有引物二聚体形成。可能是你的目的基因的丰度太低，所以效率上不去，用浓度高一点的模板试试。
赞一下 回复此楼
2楼2012-11-14 12:33:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天一止水

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-14 12:33:28
从熔解曲线看是不错的，没有引物二聚体形成。可能是你的目的基因的丰度太低，所以效率上不去，用浓度高一点的模板试试。

谢谢指教，上午延长了退火和延伸的时间，从30s延长到60s了，除去两个点后两个的扩增效率分别是93.8和93.2%，相关系数也很好，但是看到论坛里说相对定量扩增效率要达到95-105%，打算再 降低退火温度为59°试试，不知效果怎么样呢。谢谢你
赞一下 回复此楼
3楼2012-11-14 14:53:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天一止水

新虫 (初入文坛)
wizardfan: 帖子右下角有个评分的键，请给对你有帮助的帖子金币 2012-11-15 08:58:05
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-14 12:33:28
从熔解曲线看是不错的，没有引物二聚体形成。可能是你的目的基因的丰度太低，所以效率上不去，用浓度高一点的模板试试。

对了  我是不是要给你金币啊   怎么弄呢？
赞一下 回复此楼
4楼2012-11-14 14:55:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

berniehuang

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
内参基因应该是表达丰度比较高且相对恒定的，内参基因的扩增效率也不是很好，可能还是引物的问题。多设几个退火温度的梯度，还要务必要保证模板的质量，不要有蛋白或RNA的污染。建议如有文献上能查到引物序列，就直接合成即可；如果查不到，就多合成几对，摸索一下退火温度试试。
赞一下 回复此楼
5楼2012-11-15 08:48:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 天一止水 at 2012-11-14 14:53:46
谢谢指教，上午延长了退火和延伸的时间，从30s延长到60s了，除去两个点后两个的扩增效率分别是93.8和93.2%，相关系数也很好，但是看到论坛里说相对定量扩增效率要达到95-105%，打算再 降低退火温度为59°试试，不知 ...

引物的退火温度最好做一个梯度摸一下。一般做qPCR的退火温度最好在60°C以上，退火和延伸一步完成。
赞一下 回复此楼
6楼2012-11-15 08:53:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 天一止水 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 288求调剂 +11 没有答案_ 2026-04-05 11/550 2026-04-07 14:35 by qlm5820
[考研] 学硕化学工程与技术，一志愿中国海洋大学320+求调剂 +9 披星河 2026-04-02 9/450 2026-04-07 12:53 by 尽舜尧1
[考研] 材料调剂 +17 小刘同学吖吖 2026-04-06 18/900 2026-04-07 11:41 by 诗与自由
[考研] 一志愿211，0703化学305分求调剂 +11 严西西戏 2026-04-06 12/600 2026-04-07 10:33 by flydream1314
[考研] 081200-11408-367学硕求调剂 +4 1_2_3111 2026-04-06 4/200 2026-04-07 08:13 by jp9609
[考研] 材料调剂 +5 小刘同学吖吖 2026-04-06 5/250 2026-04-06 18:34 by sherry_1901
[考研] 308求调剂 +13 倘若起风了呢 2026-04-05 13/650 2026-04-06 14:20 by 蒋皓禹
[考研] 319求调剂 +3 handrui 2026-04-05 3/150 2026-04-06 09:33 by jp9609
[考研] 301求调剂 +6 细胞相关蛋白 2026-04-02 10/500 2026-04-06 08:34 by jp9609
[考研] 工科08专硕机械275求调剂 +3 AaAa7420 2026-04-02 3/150 2026-04-05 13:26 by jp9609
[考研] 278求调剂 +3 依旧！ 2026-04-02 4/200 2026-04-04 20:27 by 蓝云思雨
[考研] 一志愿沪9，求生物学调剂，326分 +6 刘墨墨 2026-04-04 6/300 2026-04-04 19:44 by 唐沐儿
[考研] 357求调剂 +13 1050389037 2026-04-03 13/650 2026-04-03 22:27 by 无际的草原
[考研] 366求调剂 +7 sbdnd 2026-04-03 7/350 2026-04-03 12:40 by cymywx
[考研] 一志愿山东大学，085600，344 +7 魏子per 2026-04-02 8/400 2026-04-02 21:12 by 百灵童888
[考研] 22408 266求调剂 +3 masss11222 2026-04-02 3/150 2026-04-02 18:11 by 笔落锦州
[考研] 08开头看过来！！！ +4 wwwwffffff 2026-03-31 6/300 2026-04-02 11:42 by 均值回归
[考研] 材料调剂 +12 一样YWY 2026-04-01 12/600 2026-04-02 09:15 by olim
[考研] 296求调剂 +4 汪！？！ 2026-03-31 7/350 2026-04-01 22:04 by 客尔美德
[考研] 江苏科技大学招材料研究生 +4 Su032713. 2026-04-01 5/250 2026-04-01 22:03 by cccchenso
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭