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天一止水

新虫 (初入文坛)

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[求助] 相对定量中怎样提高扩增效率

我现在在做相对定量，做到了确定目的基因和内参基因扩增扩增效率一致这一步，用的是takara的realtime pcr sybr green，目的片段和内参基因片段分别是160和180bp,程序也是takara说明书上的，95 30s, (95 5s ， 60 30s)40个循环，样品是连续稀释5倍的，现在把图片上传给大家看，求助怎样能再提高内参的扩增效率，因为看到两个要都在95%-105%才可以

II5DZ$NWSZ6{@(8ZU]ES(6H.jpg

目的基因溶解曲线.jpg

内参溶解曲线.jpg

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1楼 2012-11-14 08:55:27

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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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专业: 生物化学

【答案】应助回帖

引用回帖:

3楼: Originally posted by 天一止水 at 2012-11-14 14:53:46
谢谢指教，上午延长了退火和延伸的时间，从30s延长到60s了，除去两个点后两个的扩增效率分别是93.8和93.2%，相关系数也很好，但是看到论坛里说相对定量扩增效率要达到95-105%，打算再降低退火温度为59°试试，不知 ...

引物的退火温度最好做一个梯度摸一下。一般做qPCR的退火温度最好在60°C以上，退火和延伸一步完成。