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shiliyusly新虫 (小有名气)
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QPCR 溶解曲线
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各位大侠，本人是食品研究生，现在要研究分子，有几个问题想请教大家，还麻烦高手请教，在下感激不尽！！！ 试验目的：测一个品种杨梅 5个不同成熟度DAF57,71,85,99,113 花色苷合成途径不同酶基因表达丰度的差异。 采用实时荧光定量PCR测定（仪器是Agilent stratagene），以ACT基因为内标基因，2△Ct计算待测基因与内标基因表达的相对强度。 下图：左图是基因5个成熟度 基因表达的相对强度；右图是该基因溶解曲线图 问题： 1 上图这些基因的溶解曲线是不是表明该基因QPCR的结果不可用？要怎么改进提高特异性呢？我用普通PCR很努力摸过退火温度了。 2文献里一样是杨梅，一样的基因，引物也一样的条件下，我测定QPCR相对表达强度的值比文献低10-100倍甚至更大，有关系吗？问题大吗？见下图：  未命名.jpg  2.jpg  3.jpg  未命名111.jpg  2222.jpg |
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2楼2013-01-19 23:55:16
cicelyzh
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| 熔解曲线里那些低于80°C的峰一般是引物二聚体造成的。非特异产物分两种情况，有可能熔解温度和目标基因差不多，如果目标基因是属于多基因家族的话，有可能发生这样的情况。这样可能造成目标峰变宽。你的有些图里面可能存在这个问题。还有可能有非特异扩增的小片段，形成低温度熔解峰。总之，你的熔解曲线很有问题，说明是扩增不特性和引物二聚体。不知道你是否做了扩增效率，我敢断言不会是90-110%。优化退火温度最好用qPCR的体系。因为普通PCR是扩增到平台期，qPCR检测产物时是线性期。而且qPCR的体系和普通PCR也有些差异。 |
3楼2013-01-20 02:06:16
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| 坛子里之前有个专门讲用染料法（2-deltadelta Ct）做相对定量的帖子，可以翻出来看看，挺有用的 |
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shiliyusly
7楼2013-01-21 10:14:11
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