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beescity

至尊木虫 (著名写手)


[交流] 如何确定引物二聚体和扩增产物的Tm值?

最近在做qPCR,今天遇到个样品的浓度很低,想看看能不能做出样品10倍梯度稀释的曲线,于是照常做了。
结果最后的溶解曲线发现,头三个的Tm是84,之后的5个样品时77。从Ct值来看,也是头三个还有点像样,后面的Ct都是33-34.

很显然后面的5个应该不是扩增产物,应该是奈不住寂寞的引物二聚体之类的非目的产物。
这类杂志的Tm值,能有办法界定吗?
还有,目的扩增产物的Tm值又该怎么查询呢?这个问得是具体操作啦。就算用软件,也还是告知一下操作流程。

谢谢啦!
还是补个图吧,意思一下就是啦。这只是一时手痒做的,不是很好啦。


[ Last edited by beescity on 2012-10-9 at 22:55 ]
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chenguestc

木虫 (职业作家)


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beescity: 金币+1 2012-10-10 09:02:06
不用查,最好的办法就是把PCR产物跑个胶,加MARKER,就一目了然了。
2楼2012-10-10 08:19:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
beescity: 金币+1 2012-10-10 09:00:47
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-10-10 19:14:55
引物二聚体通常比扩增产物低的温度下融化。所以看你的melting curve那几个77度的肯定是因为二聚体了。从你的那三个84度的也有低温度产物的小鼓包。其实形不形成引物二聚体和引物的设计有关,好的引物即使是用负对照模板也不会有引物二聚体形成的。CT 33,34的应该不算什么。我还做过丰度特别低的基因,CT在36,也没有引物二聚体形成。如果想做好qPCR,你最好重新设计下引物。
3楼2012-10-10 08:36:33
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beescity

至尊木虫 (著名写手)


引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-10 08:36:33
引物二聚体通常比扩增产物低的温度下融化。所以看你的melting curve那几个77度的肯定是因为二聚体了。从你的那三个84度的也有低温度产物的小鼓包。其实形不形成引物二聚体和引物的设计有关,好的引物即使是用负对照 ...

原来如此。这对引物不是很好,的确准备换了。
4楼2012-10-10 09:01:34
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