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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何确定引物二聚体和扩增产物的Tm值？
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beescity

至尊木虫 (著名写手)

[交流] 如何确定引物二聚体和扩增产物的Tm值？

最近在做qPCR，今天遇到个样品的浓度很低，想看看能不能做出样品10倍梯度稀释的曲线，于是照常做了。
结果最后的溶解曲线发现，头三个的Tm是84，之后的5个样品时77。从Ct值来看，也是头三个还有点像样，后面的Ct都是33-34.

很显然后面的5个应该不是扩增产物，应该是奈不住寂寞的引物二聚体之类的非目的产物。
这类杂志的Tm值，能有办法界定吗？
还有，目的扩增产物的Tm值又该怎么查询呢？这个问得是具体操作啦。就算用软件，也还是告知一下操作流程。

谢谢啦！
还是补个图吧，意思一下就是啦。这只是一时手痒做的，不是很好啦。


[ Last edited by beescity on 2012-10-9 at 22:55 ]
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1楼 2012-10-09 22:52:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★
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beescity: 金币+1 2012-10-10 09:00:47
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-10-10 19:14:55
引物二聚体通常比扩增产物低的温度下融化。所以看你的melting curve那几个77度的肯定是因为二聚体了。从你的那三个84度的也有低温度产物的小鼓包。其实形不形成引物二聚体和引物的设计有关，好的引物即使是用负对照模板也不会有引物二聚体形成的。CT 33,34的应该不算什么。我还做过丰度特别低的基因，CT在36，也没有引物二聚体形成。如果想做好qPCR，你最好重新设计下引物。
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3楼2012-10-10 08:36:33
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chenguestc

木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
beescity: 金币+1 2012-10-10 09:02:06
不用查，最好的办法就是把PCR产物跑个胶，加MARKER，就一目了然了。
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2楼2012-10-10 08:19:54
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beescity

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-10 08:36:33
引物二聚体通常比扩增产物低的温度下融化。所以看你的melting curve那几个77度的肯定是因为二聚体了。从你的那三个84度的也有低温度产物的小鼓包。其实形不形成引物二聚体和引物的设计有关，好的引物即使是用负对照 ...

原来如此。这对引物不是很好，的确准备换了。
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4楼2012-10-10 09:01:34
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