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如何确定引物二聚体和扩增产物的Tm值？
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最近在做qPCR，今天遇到个样品的浓度很低，想看看能不能做出样品10倍梯度稀释的曲线，于是照常做了。 结果最后的溶解曲线发现，头三个的Tm是84，之后的5个样品时77。从Ct值来看，也是头三个还有点像样，后面的Ct都是33-34. 很显然后面的5个应该不是扩增产物，应该是奈不住寂寞的引物二聚体之类的非目的产物。 这类杂志的Tm值，能有办法界定吗？ 还有，目的扩增产物的Tm值又该怎么查询呢？这个问得是具体操作啦。就算用软件，也还是告知一下操作流程。 谢谢啦！ 还是补个图吧，意思一下就是啦。这只是一时手痒做的，不是很好啦。  [ Last edited by beescity on 2012-10-9 at 22:55 ] |
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2楼2012-10-10 08:19:54
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beescity: 金币+1 2012-10-10 09:00:47
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-10-10 19:14:55
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| 引物二聚体通常比扩增产物低的温度下融化。所以看你的melting curve那几个77度的肯定是因为二聚体了。从你的那三个84度的也有低温度产物的小鼓包。其实形不形成引物二聚体和引物的设计有关，好的引物即使是用负对照模板也不会有引物二聚体形成的。CT 33,34的应该不算什么。我还做过丰度特别低的基因，CT在36，也没有引物二聚体形成。如果想做好qPCR，你最好重新设计下引物。 |
3楼2012-10-10 08:36:33
4楼2012-10-10 09:01:34