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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助/交流】有引物二聚体、非特异性扩增带是怎么回事？
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hupeng

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】有引物二聚体、非特异性扩增带是怎么回事？ 已有8人参与

请问一下各位大虾：
    我pcr反应后出现引物二聚体和多条非特异性扩增带，怎样解决呢？
    还有我目的片段只有87bp，怎样才能跑出一个比较好的结果。
    注：
         pcr反应液：taq酶（5U/μL）  0.2μL
                            10*pcr buffer      2.5μL
                            dNTP                   2μL
                            模板DNA              1.25μL
                            引物1                   1μL
                            引物2                    1μL
                            灭菌水                 up to 25μL
        pcr反应条件：94℃                 50sec
                              54℃                  30sec      （Tm值52℃）
                              72℃                  20sec       共35个循环
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智者务其实，愚者争其名！
1楼 2011-03-21 15:50:22
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jiangzhiang

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
请问是特异性引物还是简并引物？一般都有引物二聚体，不过设计的时候尽量是用软件看看，还有可以提升下退火，看看能不能消掉费特异性条带，这么短的片段是准备跑qPCR??
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2楼2011-03-21 16:21:37
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hupeng

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by jiangzhiang at 2011-03-21 16:21:37:
请问是特异性引物还是简并引物？一般都有引物二聚体，不过设计的时候尽量是用软件看看，还有可以提升下退火，看看能不能消掉费特异性条带，这么短的片段是准备跑qPCR??

是特异性引物。我做的sex marker，引物是别人发表文章里面的，但是我一直没做出结果来！
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智者务其实，愚者争其名！
3楼2011-03-21 21:57:04
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jiangzhiang

铁杆木虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by hupeng at 2011-03-21 21:57:04:
是特异性引物。我做的sex marker，引物是别人发表文章里面的，但是我一直没做出结果来！

个人意见，别人的引物试试可以的话就用，不行就自己设计，文章里的引物未必就一定是真的
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4楼2011-03-22 08:52:30
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chen4

新虫 (初入文坛)
★
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引用回帖:
Originally posted by jiangzhiang at 2011-03-22 08:52:30:
个人意见，别人的引物试试可以的话就用，不行就自己设计，文章里的引物未必就一定是真的

同意楼上的意见，别人发表文章里面的引物未必就一定是真的。
我开始也用别人的引物，但是我一直没做出结果来。
还是自己设计引物吧。
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棒棒
5楼2011-03-26 08:26:30
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haitian0625

金虫 (小有名气)
★
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你没说出自己的NTP、模板浓度；另外，既然你产物那么短，又有非特异，就应该将退火温度调高，再说，你自己在做小试时就应该做梯度的以查看合适的退火温度。
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6楼2011-03-26 10:10:41
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zgb1982

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
写的条件相当于没写撒，引物连个浓度都没，加1ul不知道是多少哦。至少我现在都是加0.5ul.
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7楼2011-03-26 10:14:28
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zgb1982

木虫 (正式写手)
87bp怎么扩哦，引物加起来就50
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8楼2011-03-26 10:15:47
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0610616

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
因为目标片段比较小，可能会出现非特异性杂带，我P200左右的也会有杂带出现，进过反复回收纯化就好了
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Everythingisok!
9楼2011-03-27 16:45:50
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wcwluwei

禁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
10楼2012-05-27 20:27:33
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