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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 一个关于qPCR标准曲线的问题。谢谢！
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ericolivia

铜虫 (小有名气)

[求助] 一个关于qPCR标准曲线的问题。谢谢！

我是个新手。尝试做qPCR。模版的最高浓度为0.1ng/μL，以10倍梯度稀释得到5个梯度。奇怪的结果如下。从溶解曲线和得到的R^2还有扩增效率来看，都挺正常的吧？就是ΔRn-循环数的图很奇怪，不是平滑的曲线。请问这是为什么呢？求解答~求帮助！

ΔRn-循环数



R^2和扩增效率



溶解曲线



标准曲线
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tt
1楼 2012-04-16 10:53:20
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 专家考核, 专家辛苦！ 2012-04-16 21:09:18
这个结果很奇怪了，扩增曲线无平台期。而且溶解曲线Tm值有点低。不知你产物大小多大，你的程序设计的没问题吧？是不是仪器本身的问题呢
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2楼2012-04-16 11:10:03
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ericolivia

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-16 11:10:03:
这个结果很奇怪了，扩增曲线无平台期。而且溶解曲线Tm值有点低。不知你产物大小多大，你的程序设计的没问题吧？是不是仪器本身的问题呢

我产物136bp。仪器应该是没问题的，有别的人用过，做出来挺漂亮的。。。
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tt
3楼2012-04-16 11:16:45
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ericolivia

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-16 11:10:03:
这个结果很奇怪了，扩增曲线无平台期。而且溶解曲线Tm值有点低。不知你产物大小多大，你的程序设计的没问题吧？是不是仪器本身的问题呢

程序是95℃ 1min，然后95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 45s。然后就是溶解曲线。之前做普通PCR的时候，60℃左右的退火温度都挺好的。
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tt
4楼2012-04-16 11:21:08
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rego_wang

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励新虫！ 2012-04-16 21:09:39
你用的是什么定量试剂，要严格按照试剂中的protocol来设置反应程序，总的来说你的结果没什么问题 除了amplification plot 不漂亮以外，标准曲线的R方和eff都很好
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5楼2012-04-16 11:59:37
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ericolivia

铜虫 (小有名气)
谢谢大家的帮助。。。我再试试看好了。
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tt
6楼2012-04-16 14:04:24
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dovekaoyan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-19 13:43:17
ericolivia: 金币+10, 换试剂以后确实好多了。我用了biorad的试剂，虽然还是没有平台期，但是至少没有折线了。。。呵呵。谢谢！ 2012-05-07 14:54:29
扩增曲线怎么没有平台期啊？应该是你的扩增程序有问题，这个程序不是自己设计的，一般跟机器，还有你所用的试剂有关，我以前用的是美国AB的7300，用宝生物的试剂，它的说明书就注明如果用AB的7300用什么程序，用7500用什么程序，根本就没提到样品
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7楼2012-04-19 09:44:20
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ericolivia

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by dovekaoyan at 2012-04-19 09:44:20:
扩增曲线怎么没有平台期啊？应该是你的扩增程序有问题，这个程序不是自己设计的，一般跟机器，还有你所用的试剂有关，我以前用的是美国AB的7300，用宝生物的试剂，它的说明书就注明如果用AB的7300用什么程序，用7 ...

我用的试剂是toyobo的，机子是ABI step one的。说明书上还真没有提到这个型号的机子应该对应什么样的体系。难道这会是问题的关键吗？


谢谢各位对我的帮助！
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tt
8楼2012-04-20 17:27:12
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dovekaoyan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by ericolivia at 2012-04-20 17:27:12:
我用的试剂是toyobo的，机子是ABI step one的。说明书上还真没有提到这个型号的机子应该对应什么样的体系。难道这会是问题的关键吗？


谢谢各位对我的帮助！

你打电话给toyobo的技术支持问一下，ABI的机器很多，他应该会推荐一个合适的程序给你
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9楼2012-04-22 20:25:32
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ericolivia

铜虫 (小有名气)
谢谢大家！我最近换了伯乐的试剂用了用，还是ABI stepone的机器。结果扩增曲线还是没有平台期。但是没有折线了。我的程序就是按照说明来设的。这会不会是引物的问题啊？我设计了两个引物，结果都是这样的。。。我这个问题大概会出在哪里啊？~

跪求解答~
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tt
10楼2012-05-03 08:49:35
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