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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】qRT-PCR
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wangy0908

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】qRT-PCR

我在做qRT-PCT实验时，同一引物与同一批材料在两次技术重复中所得到的CT值不一样，差异很大，这是为什么阿。引物的特异性以及标准曲线都很好。请教各位高手！！
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1楼 2010-11-30 05:14:56
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littlehong

木虫 (初入文坛)
★
dhd997(金币+1):很活跃，鼓励 2010-11-30 08:35:25
wangy0908(金币+2): 2010-11-30 21:58:35
qPCR的稳定性是不是特别好，建议一次多做重复，取平均值，算方差，才有统计意义
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2楼2010-11-30 08:34:58
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by littlehong at 2010-11-30 08:34:58:
qPCR的稳定性是不是特别好，建议一次多做重复，取平均值，算方差，才有统计意义

因为前段时间做出来的两次重复都很吻合。看来只能多做重复了的。你们一般都做的几次技术重复的呢。以及CT的差异在多大的范围类可以接受的呢！在0.3个循环内可以不的??
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3楼2010-11-30 21:58:15
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zjlck

新虫 (初入文坛)
wangy0908(金币+1): 2010-12-01 00:05:38
我一般在一次pcr中做三个重复，配成mix，然后分装，最后加模板，重复性挺好，一般差0.1个循环左右
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4楼2010-11-30 22:41:00
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Silencess

金虫 (小有名气)
能像你请教标准曲线的问题么~~~~~~~~谢谢~~~~~~
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5楼2010-11-30 23:22:47
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wangy0908

金虫 (正式写手)
你是想问那方面的呢？？
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6楼2010-11-30 23:54:56
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zjlck at 2010-11-30 22:41:00:
我一般在一次pcr中做三个重复，配成mix，然后分装，最后加模板，重复性挺好，一般差0.1个循环左右

由于我的样本量比较大，一次PCR只能做两次重复，所以我就做了两次技术重复(两次PCR)。但是这两次pcr得差异很大。在单次PCR里面得两次重复差异最大的在0.3左右的，基本是在0.1-0.2。以及我用的是14ul 体系。这个是不是体系大一些会更加稳定一些的 呢？？
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7楼2010-12-01 00:00:56
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xiaoyu1014126

木虫 (正式写手)
原则上每一次都需要做标准曲线，这样比对才有意义的
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8楼2010-12-01 00:01:41
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by xiaoyu1014126 at 2010-12-01 00:01:41:
原则上每一次都需要做标准曲线，这样比对才有意义的

每一次都要做标准曲线是什么意思的呢？你是说在每次pcr里面都要跑一次标准曲线的还是什么的呢？
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9楼2010-12-01 00:10:26
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love_st

金虫 (著名写手)
看下CV值嘛
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10楼2010-12-01 09:46:48
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xiaoyu1014126

木虫 (正式写手)
★ ★
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-12-03 23:08:57
就是说每一次开机对未知样品进行定量的时候，都要做一个标准曲线，而不能用前面以前做的标线来进行标定，因为PCR每一次的进程都不是完全一样的，肯定存在误差，所以就是这样了
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2010-12-01 00:10:26:

每一次都要做标准曲线是什么意思的呢？你是说在每次pcr里面都要跑一次标准曲线的还是什么的呢？

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11楼2010-12-02 08:49:01
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amilie030312

金虫 (正式写手)
wangy0908(金币+1): 2010-12-02 23:07:24
同一个样本作三次重复，以便有一个不好的时候舍弃掉
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12楼2010-12-02 09:16:39
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
关键要看你的内参的重复情况
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13楼2010-12-02 10:31:05
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-12-02 10:31:05:
关键要看你的内参的重复情况

就是在筛选内参基因的时候出现这种情况。内参的标准曲线很好，但是却出现不能重复的现象！
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14楼2010-12-02 23:09:05
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2010-12-02 22:09:05:

就是在筛选内参基因的时候出现这种情况。内参的标准曲线很好，但是却出现不能重复的现象！

内参基因怎么重复？  不同样本的内参ct一样？？？？
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15楼2010-12-03 08:31:48
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-12-03 08:31:48:



内参基因怎么重复？  不同样本的内参ct一样？？？？

就是同意内参基因在同一批样品里面，在两次和三次的技术重复中得到的ct不一样。
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16楼2010-12-03 21:54:31
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
★ ★
dhd997(金币+2):热心鼓励 2010-12-04 08:17:47
wangy0908(金币+1): 2010-12-05 09:49:09
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2010-12-03 20:54:31:

就是同意内参基因在同一批样品里面，在两次和三次的技术重复中得到的ct不一样。

同一管里的模板扩内参然后ct不一样？

那多半就是 加样问题了，加 passive  reference dye 吧
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17楼2010-12-04 08:09:23
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