Originally posted by Im_suvii at 2011-05-12 18:37:32:
小虫我准备做Real-time PCR，订了引物后师兄说让我要先做个普通PCR看看引物是否work，可是跑完后做琼脂糖凝胶电泳，目的条带是101bp，但除此之外还看到很多片段，那么多条带都快胜过500的maker了，悲剧…
用 ...

Originally posted by zhuifeng7000 at 2011-05-13 17:52:12:
应该是引物的特异性不好。不知你的基因是否有同源的基因，如果有的同源基因的话设计的时候不注意可能就会导致PCR扩增出其他条带，qRT-PCR的时候也会导致溶解曲线出现不同的峰，所以你可以先比对一下看看。

Originally posted by Im_suvii at 2011-05-13 18:03:52:
有同源的但是同源性很低…
会不会是我cDNA的问题呢？cDNA放-20℃快一个月了。。。。

就是说，我可以先做个qRT-PCR？
O(∩_∩)O谢谢~~~

Originally posted by 西瓜 at 2011-05-13 18:08:45:
DNA很稳定的，cDNA当然也是，-20℃一个月没问题的。

从图上看楼主引物特异性不好啊，而特异性不好使荧光定量PCR的大忌哦！特别是，如果你用的是Sybr Green染料，它可以非特异地与双链DNA结合，都能产生荧光 ...

Originally posted by Im_suvii at 2011-05-13 18:23:28:
Sybr Premix Ex Taq跟Sybr Green是同一个东西吧？？？

Originally posted by Im_suvii at 2011-05-13 18:19:14:
用Sybr Premix Ex Taq跟Sybr Green有区别么？会不会效果好点？？
引物用Primer5比对过，特异性应该还是可以的…不过条带这么多的确会是特异性的问题……
可是因为快毕业了，重设引物有点费时间。。。有没有什 ...

Originally posted by 西瓜 at 2011-05-13 18:41:14:
把退火温度提高到60℃试试。
设计引物再怎么着也用不了一天吧？合成好也就3天4天的样子。不行的话你还是要重新设计引物。用Primer Premier 5设计的话，你把图贴来我看看。理想情况应该是false priming、Cross ...

Originally posted by Im_suvii at 2011-05-13 18:58:52:
我今天把退火温度提到了58℃好些了…Sybr的确是Takara的呐~~~
其实是这样的，我在文献里找到的Primer,然后用Premier 5检查了下…然后发去Invitrogen合成的…我们是实验室每周三发去，要到下周才能收到……
受 ...