应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR后电泳条带异常
111/2返回列表12下一页
查看: 1901  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

Im_suvii

银虫 (小有名气)

[求助] PCR后电泳条带异常

小虫我准备做Real-time PCR，订了引物后师兄说让我要先做个普通PCR看看引物是否work，可是跑完后做琼脂糖凝胶电泳，目的条带是101bp，但除此之外还看到很多片段，那么多条带都快胜过500的maker了，悲剧…
用的1微升的DNA模板，2微升的Primer，25微升体系，退火温度是55℃
求高手指点~~~~



[ Last edited by Im_suvii on 2011-5-13 at 09:28 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
小楼一夜听春雨,明朝深巷卖杏花
1楼 2011-05-12 18:37:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
Im_suvii(金币+5): 没有考虑到同源基因的问题呢，是很大提示，谢啦! 2011-05-13 18:04:56
西瓜(金币+3): good! 2011-05-13 18:05:14
引用回帖:
Originally posted by Im_suvii at 2011-05-12 18:37:32:
小虫我准备做Real-time PCR，订了引物后师兄说让我要先做个普通PCR看看引物是否work，可是跑完后做琼脂糖凝胶电泳，目的条带是101bp，但除此之外还看到很多片段，那么多条带都快胜过500的maker了，悲剧…
用 ...

应该是引物的特异性不好。不知你的基因是否有同源的基因，如果有的同源基因的话设计的时候不注意可能就会导致PCR扩增出其他条带，qRT-PCR的时候也会导致溶解曲线出现不同的峰，所以你可以先比对一下看看。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-05-13 17:52:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Im_suvii

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2011-05-13 17:52:12:
应该是引物的特异性不好。不知你的基因是否有同源的基因，如果有的同源基因的话设计的时候不注意可能就会导致PCR扩增出其他条带，qRT-PCR的时候也会导致溶解曲线出现不同的峰，所以你可以先比对一下看看。

有同源的但是同源性很低…
会不会是我cDNA的问题呢？cDNA放-20℃快一个月了。。。。

就是说，我可以先做个qRT-PCR？
O(∩_∩)O谢谢~~~
赞一下 回复此楼
小楼一夜听春雨,明朝深巷卖杏花
3楼2011-05-13 18:03:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

Im_suvii(金币+5): 分析得很有道理啊~ 2011-05-13 18:20:07
引用回帖:
Originally posted by Im_suvii at 2011-05-13 18:03:52:
有同源的但是同源性很低…
会不会是我cDNA的问题呢？cDNA放-20℃快一个月了。。。。

就是说，我可以先做个qRT-PCR？
O(∩_∩)O谢谢~~~

DNA很稳定的，cDNA当然也是，-20℃一个月没问题的。

从图上看楼主引物特异性不好啊，而特异性不好使荧光定量PCR的大忌哦！特别是，如果你用的是Sybr Green染料，它可以非特异地与双链DNA结合，都能产生荧光信号，结果肯定会不准确。

建议重新设计引物。
赞一下 回复此楼
4楼2011-05-13 18:08:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Im_suvii

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-05-13 18:08:45:
DNA很稳定的，cDNA当然也是，-20℃一个月没问题的。

从图上看楼主引物特异性不好啊，而特异性不好使荧光定量PCR的大忌哦！特别是，如果你用的是Sybr Green染料，它可以非特异地与双链DNA结合，都能产生荧光 ...

用Sybr Premix Ex Taq跟Sybr Green有区别么？会不会效果好点？？
引物用Primer5比对过，特异性应该还是可以的…不过条带这么多的确会是特异性的问题……
可是因为快毕业了，重设引物有点费时间。。。有没有什么好点的解决方法呢？
赞一下 回复此楼
小楼一夜听春雨,明朝深巷卖杏花
5楼2011-05-13 18:19:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Im_suvii

银虫 (小有名气)
Sybr Premix Ex Taq跟Sybr Green是同一个东西吧？？？
赞一下 回复此楼
小楼一夜听春雨,明朝深巷卖杏花
6楼2011-05-13 18:23:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

Im_suvii(金币+5): 2011-05-14 23:01:34
引用回帖:
Originally posted by Im_suvii at 2011-05-13 18:23:28:
Sybr Premix Ex Taq跟Sybr Green是同一个东西吧？？？

Sybr Green是一种荧光染料的名称。
Sybr Premix Ex Taq是试剂盒里一管混合的东东，里面包含了Sybr Green、Buffer、镁离子、dNTPs、Taq酶等。我猜你用的是Takara的吧，呵呵
赞一下 回复此楼
7楼2011-05-13 18:36:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

Im_suvii(金币+5): 2011-05-14 23:01:45
引用回帖:
Originally posted by Im_suvii at 2011-05-13 18:19:14:
用Sybr Premix Ex Taq跟Sybr Green有区别么？会不会效果好点？？
引物用Primer5比对过，特异性应该还是可以的…不过条带这么多的确会是特异性的问题……
可是因为快毕业了，重设引物有点费时间。。。有没有什 ...

把退火温度提高到60℃试试。
设计引物再怎么着也用不了一天吧？合成好也就3天4天的样子。不行的话你还是要重新设计引物。用Primer Premier 5设计的话，你把图贴来我看看。理想情况应该是false priming、Cross Dimer、Dimer、Hair Pin这些全部都没有。

急着毕业，还是多麻烦师兄出手吧，起码引物设计可以请他帮忙看看，呵呵呵~
赞一下 回复此楼
8楼2011-05-13 18:41:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Im_suvii

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-05-13 18:41:14:
把退火温度提高到60℃试试。
设计引物再怎么着也用不了一天吧？合成好也就3天4天的样子。不行的话你还是要重新设计引物。用Primer Premier 5设计的话，你把图贴来我看看。理想情况应该是false priming、Cross ...

我今天把退火温度提到了58℃好些了…Sybr的确是Takara的呐~~~
其实是这样的，我在文献里找到的Primer,然后用Premier 5检查了下…然后发去Invitrogen合成的…我们是实验室每周三发去，要到下周才能收到……
受不鸟了，本科生毕业的话，对图要求不会太高吧？
赞一下 回复此楼
小楼一夜听春雨,明朝深巷卖杏花
9楼2011-05-13 18:58:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
Originally posted by Im_suvii at 2011-05-13 18:58:52:
我今天把退火温度提到了58℃好些了…Sybr的确是Takara的呐~~~
其实是这样的，我在文献里找到的Primer,然后用Premier 5检查了下…然后发去Invitrogen合成的…我们是实验室每周三发去，要到下周才能收到……
受 ...

Takara的可以用到60℃的啦。我们也是用的Invitrogen，不过比你们快些，不碰上周末或过节的话，3天就可以了。毕业论文的要求你问问指导老师嘛，呵呵。
赞一下 回复此楼
10楼2011-05-15 01:03:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Im_suvii 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭