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[交流]
【求助/交流】RNA质量与qRT-PCR
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如图，RNA里有少量基因组DNA残留，这样的RNA如果反转，做定量的话会对结果产生什么样的影响？为了少量的DNA去处理一下担心会出现别的问题。另外有的RNA出现260/230过低的现象，不知道各位大神怎么解决的，请教一下。 |
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3楼2011-03-21 15:56:47
4楼2011-03-21 18:39:58
7788945(金币+3): 2011-03-21 19:40:32
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260/230的值，一般不要小于2.0，小的话表明有异硫氰酸胍，β-巯基乙醇或乙醇的残留。补救的方法是再沉淀一次，然后重复乙醇洗涤的过程。但从我的经验看，后面RNA丢得很多……因此提RNA时就注意了： 1.抽提时取上清不要贪多，避免吸到中间层和下层。RNA只要一点点就够做定量了，纯度很重要。我一般400ul上清就取100ul。 2.乙醇洗涤时，尽量让沉淀块整个悬浮起来，这样洗得充分（不要拿枪吹打，RNA沉淀散了就悲剧了……） 3.乙醇洗涤后，尽量吸干（用百枪头），然后让它充分挥发干。都说太干了后面难溶解，但我还没碰到过。看到白色的沉淀块开始变透明就可以加水溶解了。 还有一种原因可能是多糖类杂质残留，可试试用LiCl沉淀。 |
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7788945(金币+3): 2011-03-22 19:17:43
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你RNA的量很大啊，完全不用担心浓度问题了，所以抽提去上清的时候就取少一点吧。 个人经验，260/230偏小的话，提取时可以改进以下几点： 1. 加氯仿抽提后取少一点上清，不要贪多。 2.加乙醇洗的时候，多晃几次，尽量让RNA沉淀整片悬浮起来（有时候确实浮不起来也没办法。） 3.弃乙醇的时候，用枪吸而不是倾倒，倒的话经常有液滴留在管壁上，倒不干净。第一次用蓝枪头吸，可以不完全吸干，免得吸到沉淀；然后短暂离心把残余酒精甩到管底，看准了用白枪头尽量吸干净。RNA量大，被白枪头弄掉一点也没关系。 4.溶解前晾干的时间可以长一点，5分钟也没关系的。标准的做法说是不能晾太久，等沉淀开始变透明就要加水溶解，但是我晾过10分钟的，后面RNA量也很大。可能量大，虽然有些溶解不了，最后浓度还是高。 可能不完全正确，但是以前我出现过260/230偏小的问题，按上面方法改进了操作，后面就好了。 |
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