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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】RNA质量与qRT-PCR
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7788945

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】RNA质量与qRT-PCR

如图，RNA里有少量基因组DNA残留，这样的RNA如果反转，做定量的话会对结果产生什么样的影响？为了少量的DNA去处理一下担心会出现别的问题。另外有的RNA出现260/230过低的现象，不知道各位大神怎么解决的，请教一下。
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1楼 2011-03-21 15:10:55
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houpeichen

新虫 (小有名气)
★
小木虫(沙发+1，金币+0.5):恭喜抢个沙发，再给个红包
7788945(金币+1): 2011-03-21 15:54:14
是植物的RNA吧，可以用DNAaseI处理一下，然后反转录。
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2楼2011-03-21 15:43:56
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7788945

银虫 (小有名气)
忘了说明了，是植物，前两个是茎的，后两个泳道是叶片
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3楼2011-03-21 15:56:47
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
7788945(金币+1): 2011-03-21 19:34:41
设计引物的时候可以跨内含子设计，即：某条引物，其一端在外显子A上，另一端在外显子B上，中间隔一个内含子。这样，基因组DNA是扩增不出来的，只有由剪接过的RNA反转录得到的cDNA才能扩增。如果两条引物都是这样设计，你就不用担心基因组DNA的扩增了。
假如内含子很大的话，还可以这样：5‘端引物在外显子A上，3’端引物在外显子B上，中间隔个内含子。一般qRT-PCR的产物只有几百kb，因此延伸的时间也很短。中间隔个大的内含子，基因组模板相应的产物就很大，PCR程序不利于其扩增。
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4楼2011-03-21 18:39:58
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
7788945(金币+3): 2011-03-21 19:40:32
260/230的值，一般不要小于2.0，小的话表明有异硫氰酸胍，β-巯基乙醇或乙醇的残留。补救的方法是再沉淀一次，然后重复乙醇洗涤的过程。但从我的经验看，后面RNA丢得很多……因此提RNA时就注意了：
1.抽提时取上清不要贪多，避免吸到中间层和下层。RNA只要一点点就够做定量了，纯度很重要。我一般400ul上清就取100ul。
2.乙醇洗涤时，尽量让沉淀块整个悬浮起来，这样洗得充分（不要拿枪吹打，RNA沉淀散了就悲剧了……）
3.乙醇洗涤后，尽量吸干（用百枪头），然后让它充分挥发干。都说太干了后面难溶解，但我还没碰到过。看到白色的沉淀块开始变透明就可以加水溶解了。

还有一种原因可能是多糖类杂质残留，可试试用LiCl沉淀。
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5楼2011-03-21 18:52:22
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7788945

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-03-21 18:52:22:
260/230的值，一般不要小于2.0，小的话表明有异硫氰酸胍，β-巯基乙醇或乙醇的残留。补救的方法是再沉淀一次，然后重复乙醇洗涤的过程。但从我的经验看，后面RNA丢得很多……因此提RNA时就注意了：
1.抽提时取上 ...

如此说来我做的岂不是错处太多了，这两次洗涤的时候为了洗涤的彻底故意把沉淀吹起来了，这会导致小分子残留？还有吸取上清的量，400只吸取100损失是不是太多，对于叶片这样的器官可能还好点，对于根和茎就不好了吧，本来就难以保证提取的量，要是发现里边有些基因组DNA残留想要处理一下岂不是剩不下原本要留的东西
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6楼2011-03-21 19:40:07
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
Originally posted by 7788945 at 2011-03-21 19:40:07:
如此说来我做的岂不是错处太多了，这两次洗涤的时候为了洗涤的彻底故意把沉淀吹起来了，这会导致小分子残留？还有吸取上清的量，400只吸取100损失是不是太多，对于叶片这样的器官可能还好点，对于根和茎就不好了 ...

不把沉淀吹起来是怕沉淀散掉，这样弃乙醇的时候散下来的RNA就随之而去了。只需要把管子上下颠倒几次，一般整个沉淀块就能悬浮起来，这样就能洗得干净了。
我的样品比较多，所以可以这样。植物样品没提过，呵呵。不知您最后提得的RNA浓度有多少ng/uL？我的一般是300~800ng/uL。
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7楼2011-03-21 19:51:07
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
7788945(金币+1): 2011-03-22 18:55:42
引用回帖:
Originally posted by 7788945 at 2011-03-21 19:40:07:
如此说来我做的岂不是错处太多了，这两次洗涤的时候为了洗涤的彻底故意把沉淀吹起来了，这会导致小分子残留？还有吸取上清的量，400只吸取100损失是不是太多，对于叶片这样的器官可能还好点，对于根和茎就不好了 ...

我反转录用的是Takara的试剂，20ul的体系，RNA加1mg（说明书推荐用量的上限）。得到的反转录产物稀释10倍，PCR时取1ul用。因此，我的话，1mg的RNA可以做200次反应。
我提出来RNA的量从200ng到1mg/uL的都有，体积都是30ul，所以提出来RNA是远远过量了。
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8楼2011-03-21 19:56:42
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7788945

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-03-21 19:51:07:
不把沉淀吹起来是怕沉淀散掉，这样弃乙醇的时候散下来的RNA就随之而去了。只需要把管子上下颠倒几次，一般整个沉淀块就能悬浮起来，这样就能洗得干净了。
我的样品比较多，所以可以这样。植物样品没提过，呵呵 ...

看溶多少水还有提取的组织，根茎一般溶30μl，浓度1000左右，叶的RNA提取比较多，50μl有时候可以达到1500到2000，260/280的比值可以达到1.9到2.0，但260/230经常1.5左右，很闹心
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9楼2011-03-22 18:54:02
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7788945

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-03-21 19:56:42:
我反转录用的是Takara的试剂，20ul的体系，RNA加1mg（说明书推荐用量的上限）。得到的反转录产物稀释10倍，PCR时取1ul用。因此，我的话，1mg的RNA可以做200次反应。
我提出来RNA的量从200ng到1mg/uL的都有， ...

我的RNA也是用一点，剩下的用不着了，但是RNA降解太快了，为了除去里边DNA用DNase处理完我担心RNA也会降解
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10楼2011-03-22 18:57:18
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西瓜

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7788945(金币+3): 2011-03-22 19:17:43
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Originally posted by 7788945 at 2011-03-22 18:54:02:
看溶多少水还有提取的组织，根茎一般溶30μl，浓度1000左右，叶的RNA提取比较多，50μl有时候可以达到1500到2000，260/280的比值可以达到1.9到2.0，但260/230经常1.5左右，很闹心

你RNA的量很大啊，完全不用担心浓度问题了，所以抽提去上清的时候就取少一点吧。
个人经验，260/230偏小的话，提取时可以改进以下几点：
1. 加氯仿抽提后取少一点上清，不要贪多。
2.加乙醇洗的时候，多晃几次，尽量让RNA沉淀整片悬浮起来（有时候确实浮不起来也没办法。）
3.弃乙醇的时候，用枪吸而不是倾倒，倒的话经常有液滴留在管壁上，倒不干净。第一次用蓝枪头吸，可以不完全吸干，免得吸到沉淀；然后短暂离心把残余酒精甩到管底，看准了用白枪头尽量吸干净。RNA量大，被白枪头弄掉一点也没关系。
4.溶解前晾干的时间可以长一点，5分钟也没关系的。标准的做法说是不能晾太久，等沉淀开始变透明就要加水溶解，但是我晾过10分钟的，后面RNA量也很大。可能量大，虽然有些溶解不了，最后浓度还是高。

可能不完全正确，但是以前我出现过260/230偏小的问题，按上面方法改进了操作，后面就好了。
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11楼2011-03-22 19:12:32
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7788945

银虫 (小有名气)
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Originally posted by 西瓜 at 2011-03-22 19:12:32:
你RNA的量很大啊，完全不用担心浓度问题了，所以抽提去上清的时候就取少一点吧。
个人经验，260/230偏小的话，提取时可以改进以下几点：
1. 加氯仿抽提后取少一点上清，不要贪多。
2.加乙醇洗的时候，多晃几 ...

多谢！一定按你方法去做下
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12楼2011-03-22 19:18:55
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
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Originally posted by 7788945 at 2011-03-22 19:18:55:
多谢！一定按你方法去做下

散金这么多，太客气了！
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13楼2011-03-22 20:11:02
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7788945

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-03-22 20:11:02:
散金这么多，太客气了！

金币留着也不下崽
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14楼2011-03-22 20:54:54
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