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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】RNA质量与qRT-PCR
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7788945

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】RNA质量与qRT-PCR

如图，RNA里有少量基因组DNA残留，这样的RNA如果反转，做定量的话会对结果产生什么样的影响？为了少量的DNA去处理一下担心会出现别的问题。另外有的RNA出现260/230过低的现象，不知道各位大神怎么解决的，请教一下。
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1楼 2011-03-21 15:10:55
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
7788945(金币+1): 2011-03-22 18:55:42
引用回帖:
Originally posted by 7788945 at 2011-03-21 19:40:07:
如此说来我做的岂不是错处太多了，这两次洗涤的时候为了洗涤的彻底故意把沉淀吹起来了，这会导致小分子残留？还有吸取上清的量，400只吸取100损失是不是太多，对于叶片这样的器官可能还好点，对于根和茎就不好了 ...

我反转录用的是Takara的试剂，20ul的体系，RNA加1mg（说明书推荐用量的上限）。得到的反转录产物稀释10倍，PCR时取1ul用。因此，我的话，1mg的RNA可以做200次反应。
我提出来RNA的量从200ng到1mg/uL的都有，体积都是30ul，所以提出来RNA是远远过量了。
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8楼2011-03-21 19:56:42
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houpeichen

新虫 (小有名气)
★
小木虫(沙发+1，金币+0.5):恭喜抢个沙发，再给个红包
7788945(金币+1): 2011-03-21 15:54:14
是植物的RNA吧，可以用DNAaseI处理一下，然后反转录。
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2楼2011-03-21 15:43:56
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7788945

银虫 (小有名气)
忘了说明了，是植物，前两个是茎的，后两个泳道是叶片
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3楼2011-03-21 15:56:47
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
7788945(金币+1): 2011-03-21 19:34:41
设计引物的时候可以跨内含子设计，即：某条引物，其一端在外显子A上，另一端在外显子B上，中间隔一个内含子。这样，基因组DNA是扩增不出来的，只有由剪接过的RNA反转录得到的cDNA才能扩增。如果两条引物都是这样设计，你就不用担心基因组DNA的扩增了。
假如内含子很大的话，还可以这样：5‘端引物在外显子A上，3’端引物在外显子B上，中间隔个内含子。一般qRT-PCR的产物只有几百kb，因此延伸的时间也很短。中间隔个大的内含子，基因组模板相应的产物就很大，PCR程序不利于其扩增。
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4楼2011-03-21 18:39:58
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