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7788945

银虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】RNA质量与qRT-PCR

如图,RNA里有少量基因组DNA残留,这样的RNA如果反转,做定量的话会对结果产生什么样的影响?为了少量的DNA去处理一下担心会出现别的问题。另外有的RNA出现260/230过低的现象,不知道各位大神怎么解决的,请教一下。
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Originally posted by 7788945 at 2011-03-21 19:40:07:
如此说来我做的岂不是错处太多了,这两次洗涤的时候为了洗涤的彻底故意把沉淀吹起来了,这会导致小分子残留?还有吸取上清的量,400只吸取100损失是不是太多,对于叶片这样的器官可能还好点,对于根和茎就不好了 ...

不把沉淀吹起来是怕沉淀散掉,这样弃乙醇的时候散下来的RNA就随之而去了。只需要把管子上下颠倒几次,一般整个沉淀块就能悬浮起来,这样就能洗得干净了。
我的样品比较多,所以可以这样。植物样品没提过,呵呵。不知您最后提得的RNA浓度有多少ng/uL?我的一般是300~800ng/uL。
7楼2011-03-21 19:51:07
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houpeichen

新虫 (小有名气)



小木虫(沙发+1,金币+0.5):恭喜抢个沙发,再给个红包
7788945(金币+1): 2011-03-21 15:54:14
是植物的RNA吧,可以用DNAaseI处理一下,然后反转录。
2楼2011-03-21 15:43:56
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7788945

银虫 (小有名气)


忘了说明了,是植物,前两个是茎的,后两个泳道是叶片
3楼2011-03-21 15:56:47
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7788945(金币+1): 2011-03-21 19:34:41
设计引物的时候可以跨内含子设计,即:某条引物,其一端在外显子A上,另一端在外显子B上,中间隔一个内含子。这样,基因组DNA是扩增不出来的,只有由剪接过的RNA反转录得到的cDNA才能扩增。如果两条引物都是这样设计,你就不用担心基因组DNA的扩增了。
假如内含子很大的话,还可以这样:5‘端引物在外显子A上,3’端引物在外显子B上,中间隔个内含子。一般qRT-PCR的产物只有几百kb,因此延伸的时间也很短。中间隔个大的内含子,基因组模板相应的产物就很大,PCR程序不利于其扩增。
4楼2011-03-21 18:39:58
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