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[交流]
【求助/交流】RNA质量与qRT-PCR
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如图,RNA里有少量基因组DNA残留,这样的RNA如果反转,做定量的话会对结果产生什么样的影响?为了少量的DNA去处理一下担心会出现别的问题。另外有的RNA出现260/230过低的现象,不知道各位大神怎么解决的,请教一下。 |
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2楼2011-03-21 15:43:56
3楼2011-03-21 15:56:47
4楼2011-03-21 18:39:58
7788945(金币+3): 2011-03-21 19:40:32
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260/230的值,一般不要小于2.0,小的话表明有异硫氰酸胍,β-巯基乙醇或乙醇的残留。补救的方法是再沉淀一次,然后重复乙醇洗涤的过程。但从我的经验看,后面RNA丢得很多……因此提RNA时就注意了: 1.抽提时取上清不要贪多,避免吸到中间层和下层。RNA只要一点点就够做定量了,纯度很重要。我一般400ul上清就取100ul。 2.乙醇洗涤时,尽量让沉淀块整个悬浮起来,这样洗得充分(不要拿枪吹打,RNA沉淀散了就悲剧了……) 3.乙醇洗涤后,尽量吸干(用百枪头),然后让它充分挥发干。都说太干了后面难溶解,但我还没碰到过。看到白色的沉淀块开始变透明就可以加水溶解了。 还有一种原因可能是多糖类杂质残留,可试试用LiCl沉淀。 |
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7788945(金币+3): 2011-03-22 19:17:43
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你RNA的量很大啊,完全不用担心浓度问题了,所以抽提去上清的时候就取少一点吧。 个人经验,260/230偏小的话,提取时可以改进以下几点: 1. 加氯仿抽提后取少一点上清,不要贪多。 2.加乙醇洗的时候,多晃几次,尽量让RNA沉淀整片悬浮起来(有时候确实浮不起来也没办法。) 3.弃乙醇的时候,用枪吸而不是倾倒,倒的话经常有液滴留在管壁上,倒不干净。第一次用蓝枪头吸,可以不完全吸干,免得吸到沉淀;然后短暂离心把残余酒精甩到管底,看准了用白枪头尽量吸干净。RNA量大,被白枪头弄掉一点也没关系。 4.溶解前晾干的时间可以长一点,5分钟也没关系的。标准的做法说是不能晾太久,等沉淀开始变透明就要加水溶解,但是我晾过10分钟的,后面RNA量也很大。可能量大,虽然有些溶解不了,最后浓度还是高。 可能不完全正确,但是以前我出现过260/230偏小的问题,按上面方法改进了操作,后面就好了。 |
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