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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】RNA质量与qRT-PCR
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7788945

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】RNA质量与qRT-PCR

如图，RNA里有少量基因组DNA残留，这样的RNA如果反转，做定量的话会对结果产生什么样的影响？为了少量的DNA去处理一下担心会出现别的问题。另外有的RNA出现260/230过低的现象，不知道各位大神怎么解决的，请教一下。
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1楼 2011-03-21 15:10:55
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7788945

银虫 (小有名气)
忘了说明了，是植物，前两个是茎的，后两个泳道是叶片
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3楼2011-03-21 15:56:47
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houpeichen

新虫 (小有名气)
★
小木虫(沙发+1，金币+0.5):恭喜抢个沙发，再给个红包
7788945(金币+1): 2011-03-21 15:54:14
是植物的RNA吧，可以用DNAaseI处理一下，然后反转录。
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2楼2011-03-21 15:43:56
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
7788945(金币+1): 2011-03-21 19:34:41
设计引物的时候可以跨内含子设计，即：某条引物，其一端在外显子A上，另一端在外显子B上，中间隔一个内含子。这样，基因组DNA是扩增不出来的，只有由剪接过的RNA反转录得到的cDNA才能扩增。如果两条引物都是这样设计，你就不用担心基因组DNA的扩增了。
假如内含子很大的话，还可以这样：5‘端引物在外显子A上，3’端引物在外显子B上，中间隔个内含子。一般qRT-PCR的产物只有几百kb，因此延伸的时间也很短。中间隔个大的内含子，基因组模板相应的产物就很大，PCR程序不利于其扩增。
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4楼2011-03-21 18:39:58
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
7788945(金币+3): 2011-03-21 19:40:32
260/230的值，一般不要小于2.0，小的话表明有异硫氰酸胍，β-巯基乙醇或乙醇的残留。补救的方法是再沉淀一次，然后重复乙醇洗涤的过程。但从我的经验看，后面RNA丢得很多……因此提RNA时就注意了：
1.抽提时取上清不要贪多，避免吸到中间层和下层。RNA只要一点点就够做定量了，纯度很重要。我一般400ul上清就取100ul。
2.乙醇洗涤时，尽量让沉淀块整个悬浮起来，这样洗得充分（不要拿枪吹打，RNA沉淀散了就悲剧了……）
3.乙醇洗涤后，尽量吸干（用百枪头），然后让它充分挥发干。都说太干了后面难溶解，但我还没碰到过。看到白色的沉淀块开始变透明就可以加水溶解了。

还有一种原因可能是多糖类杂质残留，可试试用LiCl沉淀。
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5楼2011-03-21 18:52:22
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