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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】极度困惑QPCR时管家基因设板的问题？
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amilie030312

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】极度困惑QPCR时管家基因设板的问题？ 已有2人参与

如果有50个样本，每个样本要做10个基因的定量，想问一下大家都怎么做的。
在不计重复的情况下，大家在做的时候是一个样本的所有目标基因做完了之后，再做一个看家基，就是50个基因的结果用一个1号样本的看家基因结果来相对定量，还是每个样本的目标基因做完了都跟随一个该样本的看家基因啊？
因为我们是做板间的样本重复的，所以一块板内是没有重复的。

[ Last edited by amilie030312 on 2010-8-8 at 16:44 ]
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1楼 2010-08-08 16:30:21
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
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amisking(金币+2): 2010-08-08 18:39:04
每个样本的目的基因和内参同时在一块板跑，同时用自己制备的“标准品”（我用随便搞的cDNA分装成小份放-80，每次都扩内参），用于消除板间的误差~~

我是这么干的~~
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2楼2010-08-08 17:34:08
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amilie030312

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-08-08 17:34:08:
每个样本的目的基因和内参同时在一块板跑，同时用自己制备的“标准品”（我用随便搞的cDNA分装成小份放-80，每次都扩内参），用于消除板间的误差~~

我是这么干的~~

是说如果我一个样本作很多个基因只做一次看家基因吗？
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3楼2010-08-12 16:04:28
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
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Originally posted by amilie030312 at 2010-08-12 16:04:28:

是说如果我一个样本作很多个基因只做一次看家基因吗？

是可以这么说，只要这块板里面包含了你这个样本所有想做的基因，那么内参就做一个（3复孔）
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4楼2010-08-12 16:15:25
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amilie030312

金虫 (正式写手)
可是按照标准来讲不是应该每个样本的目标基因做完了都应该再做一个看家基因吗？我的复孔是在不同板子的相同位置，所以一块板上没重复。
我现在比较困惑的是到底该每个样本就跑一次看家基因就好还是要针对每一个目标基因都跑一次看家基因孔
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5楼2010-08-12 16:29:31
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
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Originally posted by amilie030312 at 2010-08-12 16:29:31:
可是按照标准来讲不是应该每个样本的目标基因做完了都应该再做一个看家基因吗？我的复孔是在不同板子的相同位置，所以一块板上没重复。
我现在比较困惑的是到底该每个样本就跑一次看家基因就好还是要针对每一个目 ...

每一个板都只跑一个内参，加上我之前说的“标准品”扣除误差
假定标准品的变异全部来自于每批次的机器系统误差，那么你将同样一份样品以单孔的形式重复跑三遍，那么就是相当于3个复孔了
你的内参，就相当于其中一个基因

当然其中还有你混样时候的误差，这个有ROX可矫正
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6楼2010-08-12 17:13:04
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