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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 关于基因构建中开放阅读框架的若干问题
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mjzjily

铜虫 (初入文坛)

[求助] 关于基因构建中开放阅读框架的若干问题

Sample Text
我刚接触分子生物学不久，现在做基因构建的实验设计。在阅读文献时，对开放阅读框架产生了一些疑问，请各路高手多多指导了：
1. 我看到一些原核生物基因的ORF，有一部分包含在目的基因的序列中，也有一部分甚至在该基因启动子保守序列的上游。因此，如果要获得ORF片段的话，我应该如何知道哪些片段序列是ORF？只靠预测软件吗？
2. 在原核生物的基因构建时，是不是只要将获得的目的基因片段连入载体，就可以了？还需要考虑开放阅读框架吗？若只构建目的基因，不考虑ORF，会不会影响基因的表达？
3. 此外，每个基因都有一个ORF吗？可以不含有ORF？Sample TextSample Text
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扎实科研
1楼 2012-04-07 22:20:31
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 专家考核, Good！辛苦~ 2012-04-08 16:56:03
ORF（open reading frame，开放阅读框)是DNA上的一段碱基序列，由于拥有特殊的起始密码子和直到可以从该段碱基序列产生合适大小蛋白才出现的终止密码子，该段碱基序列编码一个蛋白。ORF的识别是证明一个新的DNA序列为特定的蛋白质编码基因的部分或全部的先决条件。
1、片段序列是否ORF，自己用眼睛看太辛苦，用软件预测方便快捷，很多生物软件都能预测的，也有在线预测工具。
2、在原核生物的基因构建时，要考虑开放阅读框架的，否则影响基因的表达，出现提前蛋白表达不准确或不能表达的情况。
3、每个结构基因都有相应的每个基因ORF，编码RNA的基因一般没有ORF。
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2楼2012-04-08 11:19:05
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mjzjily

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-04-08 11:19:05:
ORF（open reading frame，开放阅读框)是DNA上的一段碱基序列，由于拥有特殊的起始密码子和直到可以从该段碱基序列产生合适大小蛋白才出现的终止密码子，该段碱基序列编码一个蛋白。ORF的识别是证明一个新的DNA序 ...

谢谢指导了。还有对于ORF的长度，我也有些疑惑。我查了很多有关原核orf的资料。我的理解是这样的。您看看是否有错？
1.全长ORF：是指只含有编码一个全长蛋白质的序列，也就是指我们平时从网上查到滴目的基因的序列（从起始密码到终止密码）。是这样吗？  
2.ORF：网上查到说，基因中的ORF包含并位于开始编码与终止编码之间。那就是说，ORF是完全包含在全长ORF（目的基因序列）中的吗？还是说，ORF中有一部分是目的基因序列，另一部分是目的基因上游的序列，包括启动子，甚至启动子更上游的序列？
3.基因构建时，要如何考虑ORF的情况，以防止阅读框架的改变？如果只克隆全长orf，再连入表达载体，会不会有阅读框架改变的可能？还是说一定要把ORF区连同目的基因一起构建入表达载体才行？

谢谢啦~~？
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扎实科研
3楼2012-04-09 16:50:10
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by mjzjily at 2012-04-09 16:50:10:
谢谢指导了。还有对于ORF的长度，我也有些疑惑。我查了很多有关原核orf的资料。我的理解是这样的。您看看是否有错？
1.全长ORF：是指只含有编码一个全长蛋白质的序列，也就是指我们平时从网上查到滴目的 ...

1、是的
2、ORF个人觉得没有全长ORF或非全长之说。
3、要考虑，是否影响阅读框架改变跟连入多长基因没有关系。最后那个“一定要把ORF区连同目的基因一起构建入表达载体才行？”看不懂什么意思。
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4楼2012-04-09 19:20:31
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mjzjily

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-04-09 19:20:31:
1、是的
2、ORF个人觉得没有全长ORF或非全长之说。
3、要考虑，是否影响阅读框架改变跟连入多长基因没有关系。最后那个“一定要把ORF区连同目的基因一起构建入表达载体才行？”看不懂什么意思。

以这张图来看，TTG是起始密码子，ORF区不仅包含了部分基因HDNO的编码序列，还有部分起始密码子上游的非编码序列。所以，我如果要构建该基因的表达载体，1. 是只要直接pcr得到起始密码子至终止密码子的目的基因片段，再连入表达载体？
2. 还是想要将那些包含启动子在内的非编码区（起始密码子之前的序列）和目的基因一起pcr下来，再连入表达载体？

我不知道那种可能会引起阅读框架的改变，如果是第二种方法的话，那如何确定那些非编码区是必须的呢？用预测ORF的软件可以吗？

谢谢啦~~

图例
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扎实科研
5楼2012-04-09 20:00:31
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mjzjily

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-04-09 19:20:31:
1、是的
2、ORF个人觉得没有全长ORF或非全长之说。
3、要考虑，是否影响阅读框架改变跟连入多长基因没有关系。最后那个“一定要把ORF区连同目的基因一起构建入表达载体才行？”看不懂什么意思。

补充一个：图中标出的ORF区域就是该基因HDNO的orf区吗？还是说标出的只是部分ORF？
谢谢
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扎实科研
6楼2012-04-09 20:03:16
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by mjzjily at 2012-04-09 20:03:16:
补充一个：图中标出的ORF区域就是该基因HDNO的orf区吗？还是说标出的只是部分ORF？
谢谢

不是，是另一个ORF，两个没有关系，也不是同一条编码链。HDNO的ORF从TTG开始，后面的没画出来。
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7楼2012-04-09 21:29:08
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yangjianchen

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mjzjily at 2012-04-09 16:50:10
谢谢指导了。还有对于ORF的长度，我也有些疑惑。我查了很多有关原核orf的资料。我的理解是这样的。您看看是否有错？
1.全长ORF：是指只含有编码一个全长蛋白质的序列，也就是指我们平时从网上查到滴目的基 ...

请问连入的片段除了完整ORF之外在5端和3端多了一些序列可有影响？还有加入在3端终止密码子下游不远处出现了新的ATG会不会产生新的表达蛋白（该ATG上游相近的地方没有启动子）？
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8楼2013-08-21 09:08:16
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