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ericolivia

铜虫 (小有名气)

[求助] 一个关于qPCR标准曲线的问题。谢谢!

我是个新手。尝试做qPCR。模版的最高浓度为0.1ng/μL,以10倍梯度稀释得到5个梯度。奇怪的结果如下。从溶解曲线和得到的R^2还有扩增效率来看,都挺正常的吧?就是ΔRn-循环数的图很奇怪,不是平滑的曲线。请问这是为什么呢?求解答~求帮助!

ΔRn-循环数



R^2和扩增效率



溶解曲线



标准曲线
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tt
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ericolivia

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-16 11:10:03:
这个结果很奇怪了,扩增曲线无平台期。而且溶解曲线Tm值有点低。不知你产物大小多大,你的程序设计的没问题吧?是不是仪器本身的问题呢

程序是95℃ 1min,然后95℃ 15s,60℃ 15s,72℃ 45s。然后就是溶解曲线。之前做普通PCR的时候,60℃左右的退火温度都挺好的。
tt
4楼2012-04-16 11:21:08
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 专家考核, 专家辛苦! 2012-04-16 21:09:18
这个结果很奇怪了,扩增曲线无平台期。而且溶解曲线Tm值有点低。不知你产物大小多大,你的程序设计的没问题吧?是不是仪器本身的问题呢
2楼2012-04-16 11:10:03
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ericolivia

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-16 11:10:03:
这个结果很奇怪了,扩增曲线无平台期。而且溶解曲线Tm值有点低。不知你产物大小多大,你的程序设计的没问题吧?是不是仪器本身的问题呢

我产物136bp。仪器应该是没问题的,有别的人用过,做出来挺漂亮的。。。
tt
3楼2012-04-16 11:16:45
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rego_wang

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励新虫! 2012-04-16 21:09:39
你用的是什么定量试剂,要严格按照试剂中的protocol来设置反应程序,总的来说你的结果没什么问题 除了amplification plot 不漂亮以外,标准曲线的R方和eff都很好
5楼2012-04-16 11:59:37
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