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ericolivia

铜虫 (小有名气)

[求助] 一个关于qPCR标准曲线的问题。谢谢!

我是个新手。尝试做qPCR。模版的最高浓度为0.1ng/μL,以10倍梯度稀释得到5个梯度。奇怪的结果如下。从溶解曲线和得到的R^2还有扩增效率来看,都挺正常的吧?就是ΔRn-循环数的图很奇怪,不是平滑的曲线。请问这是为什么呢?求解答~求帮助!

ΔRn-循环数



R^2和扩增效率



溶解曲线



标准曲线
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tt
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 专家考核, 专家辛苦! 2012-04-16 21:09:18
这个结果很奇怪了,扩增曲线无平台期。而且溶解曲线Tm值有点低。不知你产物大小多大,你的程序设计的没问题吧?是不是仪器本身的问题呢
2楼2012-04-16 11:10:03
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ericolivia

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-16 11:10:03:
这个结果很奇怪了,扩增曲线无平台期。而且溶解曲线Tm值有点低。不知你产物大小多大,你的程序设计的没问题吧?是不是仪器本身的问题呢

我产物136bp。仪器应该是没问题的,有别的人用过,做出来挺漂亮的。。。
tt
3楼2012-04-16 11:16:45
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ericolivia

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-16 11:10:03:
这个结果很奇怪了,扩增曲线无平台期。而且溶解曲线Tm值有点低。不知你产物大小多大,你的程序设计的没问题吧?是不是仪器本身的问题呢

程序是95℃ 1min,然后95℃ 15s,60℃ 15s,72℃ 45s。然后就是溶解曲线。之前做普通PCR的时候,60℃左右的退火温度都挺好的。
tt
4楼2012-04-16 11:21:08
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rego_wang

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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西瓜: 金币+2, 鼓励新虫! 2012-04-16 21:09:39
你用的是什么定量试剂,要严格按照试剂中的protocol来设置反应程序,总的来说你的结果没什么问题 除了amplification plot 不漂亮以外,标准曲线的R方和eff都很好
5楼2012-04-16 11:59:37
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ericolivia

铜虫 (小有名气)

谢谢大家的帮助。。。我再试试看好了。
tt
6楼2012-04-16 14:04:24
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dovekaoyan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-19 13:43:17
ericolivia: 金币+10, 换试剂以后确实好多了。我用了biorad的试剂,虽然还是没有平台期,但是至少没有折线了。。。呵呵。谢谢! 2012-05-07 14:54:29
扩增曲线怎么没有平台期啊?应该是你的扩增程序有问题,这个程序不是自己设计的,一般跟机器,还有你所用的试剂有关,我以前用的是美国AB的7300,用宝生物的试剂,它的说明书就注明如果用AB的7300用什么程序,用7500用什么程序,根本就没提到样品
7楼2012-04-19 09:44:20
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ericolivia

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by dovekaoyan at 2012-04-19 09:44:20:
扩增曲线怎么没有平台期啊?应该是你的扩增程序有问题,这个程序不是自己设计的,一般跟机器,还有你所用的试剂有关,我以前用的是美国AB的7300,用宝生物的试剂,它的说明书就注明如果用AB的7300用什么程序,用7 ...

我用的试剂是toyobo的,机子是ABI step one的。说明书上还真没有提到这个型号的机子应该对应什么样的体系。难道这会是问题的关键吗?


谢谢各位对我的帮助!
tt
8楼2012-04-20 17:27:12
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dovekaoyan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by ericolivia at 2012-04-20 17:27:12:
我用的试剂是toyobo的,机子是ABI step one的。说明书上还真没有提到这个型号的机子应该对应什么样的体系。难道这会是问题的关键吗?


谢谢各位对我的帮助!

你打电话给toyobo的技术支持问一下,ABI的机器很多,他应该会推荐一个合适的程序给你
9楼2012-04-22 20:25:32
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ericolivia

铜虫 (小有名气)

谢谢大家!我最近换了伯乐的试剂用了用,还是ABI stepone的机器。结果扩增曲线还是没有平台期。但是没有折线了。我的程序就是按照说明来设的。这会不会是引物的问题啊?我设计了两个引物,结果都是这样的。。。我这个问题大概会出在哪里啊?~

跪求解答~
tt
10楼2012-05-03 08:49:35
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