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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教蛋白冻干的问题
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sxxuan

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】请教蛋白冻干的问题

疏水层析后，想冻干得到蛋白，请问是直接抽真空冻干吗？要不要脱盐、加冻干保护剂的？如果加的话，加什么呢？谢谢大家啊
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1楼 2010-12-06 10:22:43
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-12-06 20:58:31
sxxuan(金币+1): 2010-12-10 10:04:14
直接冻干试试。脱盐可能影响蛋白质结构，加保护剂可能影响冻干效果。
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2楼2010-12-06 20:37:15
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wlt728

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-12-06 20:58:42
sxxuan(金币+1): 2010-12-10 10:04:19
如果蛋白用量少的话，可以不用除盐！加点保护剂可以的
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3楼2010-12-06 20:41:20
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by wlt728 at 2010-12-06 20:41:20:
如果蛋白用量少的话，可以不用除盐！加点保护剂可以的

是要做标准品的，所以要求比较高。保护剂可以放什么呢？谢谢你
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4楼2010-12-08 09:15:33
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by jurkat.1640 at 2010-12-06 20:37:15:
直接冻干试试。脱盐可能影响蛋白质结构，加保护剂可能影响冻干效果。

好的，谢谢你。不过残留盐分队以后的实验有没有影响？
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5楼2010-12-08 09:16:21
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YaYa785

银虫 (小有名气)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-10 09:07:24
直接冻干就可以，要做标准品 ，你确定纯度行么？
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6楼2010-12-08 11:15:45
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by YaYa785 at 2010-12-08 11:15:45:
直接冻干就可以，要做标准品 ，你确定纯度行么？

就是因为什么都还没确定，又没有测定，才头疼呢
不知道残留的盐分对后面的影响怎样
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7楼2010-12-09 10:36:12
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sxxuan

金虫 (著名写手)
reasonspare:在你发帖子的时候，选择：我要发放金币: 把自己的部分金币发放给回帖者。填写你发放金币的数量，选择人工发放，就可以给所以你认为理想的解答者，以金币报酬 2010-12-10 11:33:21
不会发送金币怎么办？
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8楼2010-12-09 10:36:46
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austin2008

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-09 11:50:14
sxxuan(金币+1): 2010-12-10 10:04:32
最好加点保护剂（2%的葡萄糖或山梨醇，蔗糖等），真空冷冻干燥，使液体表面积大点好，干燥的快些

[ Last edited by austin2008 on 2010-12-9 at 10:57 ]
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9楼2010-12-09 10:56:00
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YaYa785

银虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):good 2010-12-09 11:50:05
sxxuan(金币+1): 2010-12-10 10:04:42
引用回帖:
Originally posted by sxxuan at 2010-12-09 10:36:12:

就是因为什么都还没确定，又没有测定，才头疼呢
不知道残留的盐分对后面的影响怎样

那我建议你 先用你能找到的办法  每种方法都做一遍做完之后比较一下，比较的方法最好是和你后续试验相关的，而且 也要联系你分离用的方法...最好呢是做3遍以上，得到的数据比较可靠....
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10楼2010-12-09 11:05:20
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by austin2008 at 2010-12-09 10:56:00:
最好加点保护剂（2%的葡萄糖或山梨醇，蔗糖等），真空冷冻干燥，使液体表面积大点好，干燥的快些

[ Last edited by austin2008 on 2010-12-9 at 10:57 ]

嗯，受教了
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11楼2010-12-09 13:53:01
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by YaYa785 at 2010-12-09 11:05:20:



那我建议你 先用你能找到的办法  每种方法都做一遍做完之后比较一下，比较的方法最好是和你后续试验相关的，而且 也要联系你分离用的方法...最好呢是做3遍以上，得到的数据比较可靠....

哎，做科研真痛苦
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12楼2010-12-09 13:53:45
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vicarner

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这可是一个系统工程啊。要研究你目的蛋白的稳定条件、冻干保护、冻干曲线，冻干后稳定性等等太多了。
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13楼2010-12-09 14:14:53
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YaYa785

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by sxxuan at 2010-12-09 13:53:45:

哎，做科研真痛苦

既然选择了就认证对待....态度决定高度...
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14楼2010-12-10 08:35:42
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AZURESKY1999

至尊木虫 (知名作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2):热心鼓励 2010-12-10 09:08:33
sxxuan(金币+1): 2010-12-10 10:03:04
不知道楼主冻干蛋白后做何用途，如果不考虑蛋白质的纯度，只考虑活性，可以考虑加入适量的白蛋白或者海藻糖或者甘露醇之类的保护剂再进行冻干，如果要考虑纯度，那就要另行想办法了，有的蛋白质中可以在液体中加入PMSF进行保护，可以保护纯度，免受蛋白降解的
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15楼2010-12-10 08:52:38
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AZURESKY1999

至尊木虫 (知名作家)
此外，在蛋白质冻干时，缓冲液中的盐浓度不能太高，可以考虑用G25脱盐柱把缓冲液换为0.02M 的PBS溶液的，具体要结合蛋白的实际情况
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16楼2010-12-10 08:54:21
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chi247

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
sxxuan(金币+1): 2010-12-10 10:03:21
既然要做标准品的，最好什么都不要加，除去盐分就可以了。不需要加什么保护剂的。
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17楼2010-12-10 09:04:33
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dhd997

荣誉版主 (文坛精英)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by sxxuan at 2010-12-09 10:36:46:
不会发送金币怎么办？

有问题可以直接找版主，追加金币可以发金币。也可以由版主代发。
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18楼2010-12-10 09:08:19
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by dhd997 at 2010-12-10 09:08:19:

有问题可以直接找版主，追加金币可以发金币。也可以由版主代发。

原来这样子啊，谢谢啊
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19楼2010-12-10 09:57:55
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by chi247 at 2010-12-10 09:04:33:
既然要做标准品的，最好什么都不要加，除去盐分就可以了。不需要加什么保护剂的。

最近用超滤管去除盐，不过有个问题是质粒污染比较严重
现在不知道先用疏水层析纯化蛋白后再超滤，还是超滤后再纯化。
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20楼2010-12-10 09:59:26
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by AZURESKY1999 at 2010-12-10 08:52:38:
不知道楼主冻干蛋白后做何用途，如果不考虑蛋白质的纯度，只考虑活性，可以考虑加入适量的白蛋白或者海藻糖或者甘露醇之类的保护剂再进行冻干，如果要考虑纯度，那就要另行想办法了，有的蛋白质中可以在液体中加入 ...

可能对纯度的要求比较高~
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21楼2010-12-10 10:00:07
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by vicarner at 2010-12-09 14:14:53:
这可是一个系统工程啊。要研究你目的蛋白的稳定条件、冻干保护、冻干曲线，冻干后稳定性等等太多了。

就是看到文献和资料里面说的冻干曲线之类的，才觉得太麻烦了。以前连蛋白都没有接触过
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22楼2010-12-10 10:01:13
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chi247

木虫 (小有名气)
sxxuan(金币+1): 2010-12-13 09:39:03
现在不知道先用疏水层析纯化蛋白后再超滤，还是超滤后再纯化。----你超滤后再纯化，盐分岂不又在蛋白中了？
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23楼2010-12-10 10:18:15
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AZURESKY1999

至尊木虫 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★
sxxuan(金币+1): 2010-12-13 09:38:06
scelab(金币+5):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-12-17 00:09:33
如果单纯除盐的话，样品体积也不大，也可以考虑用透析袋进行除盐，不过透析袋要有选择的，就是透析袋析袋要有分子截流量的选择，将所除盐的样品装入透析袋中，两边封紧口，放入到至少10倍于样品体积的缓冲溶液中，如0.02M PBS，最好烧杯中放入一个磁子，在磁子转动的条件下进行透析，这样可以加快达到除盐的目的。一般换两到三次的溶液就可以达到除盐的目的了
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24楼2010-12-10 15:52:09
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by chi247 at 2010-12-10 10:18:15:
现在不知道先用疏水层析纯化蛋白后再超滤，还是超滤后再纯化。----你超滤后再纯化，盐分岂不又在蛋白中了？

是啊，我也是这样想的，但是老板的意思是两个都要试一下。超滤后纯化，又要再超滤一下，很麻烦的呢
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25楼2010-12-13 09:37:59
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by AZURESKY1999 at 2010-12-10 15:52:09:
如果单纯除盐的话，样品体积也不大，也可以考虑用透析袋进行除盐，不过透析袋要有选择的，就是透析袋析袋要有分子截流量的选择，将所除盐的样品装入透析袋中，两边封紧口，放入到至少10倍于样品体积的缓冲溶液中， ...

嗯，谢谢你。之前也试过透析，但是损失比较大。
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26楼2010-12-13 09:38:44
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AZURESKY1999

至尊木虫 (知名作家)
sxxuan(金币+2): 2010-12-17 09:21:31
sxxuan(金币+1): 2010-12-20 11:42:58
引用回帖:
Originally posted by sxxuan at 2010-12-13 09:38:44:

嗯，谢谢你。之前也试过透析，但是损失比较大。

损失大的原因可能是你所用的透析袋的分子截留量孔径与你的目的蛋白的分子量接近，所以造成蛋白损失较多，因为透析袋的孔径不是均一的，有大有小
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27楼2010-12-16 21:51:05
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by AZURESKY1999 at 2010-12-16 21:51:05:

损失大的原因可能是你所用的透析袋的分子截留量孔径与你的目的蛋白的分子量接近，所以造成蛋白损失较多，因为透析袋的孔径不是均一的，有大有小

嗯，文献上说的大小和实际的大小不一样。这里用的方法好像和正常的也不一样。也没有检查蛋白的大小
其实我要做的实验就是，原核表达蛋白，然后疏水层析纯化，再以超滤管或什么方法除盐浓缩蛋白，最后冻干的。现在就停留在疏水层析这个过程，效果很一般，所以后面的冻干都没有往下做。正确的来说，连冻干机都还没买回来
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28楼2010-12-17 09:21:24
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AZURESKY1999

至尊木虫 (知名作家)
sxxuan(金币+1): 2010-12-20 11:43:23
引用回帖:
Originally posted by sxxuan at 2010-12-17 09:21:24:

嗯，文献上说的大小和实际的大小不一样。这里用的方法好像和正常的也不一样。也没有检查蛋白的大小
其实我要做的实验就是，原核表达蛋白，然后疏水层析纯化，再以超滤管或什么方法除盐浓缩蛋白，最后冻干的。现 ...

除盐的方式有很多，主要是根据目的蛋白的多少可以确定，但肯定的是多一个操作步骤，就多一些损失，特别是对于蛋白质量不多的来说，一定要慎重。如果蛋白量多，可以考虑G-25除盐，也可以考虑离子交换、包括阴离子交换和阳离子交换，如DEAE、CM、Q等离子交换，也可以用疏水层析法，上述方法要求蛋白量要多一些，并且离子交换和疏水层析还有可能去除杂蛋白，如果蛋白量少，只能考虑超滤和透析袋的方式了
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29楼2010-12-17 10:13:18
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xhjggl

木虫 (正式写手)
做标准品还是要脱盐的，再冻干。上海生工就有。

重力型去盐柱     
DeSalting Column        
产品说明：即用型重力Sephadex脱盐柱从小分子的盐或其他缓冲体系中分离分子量大于5000的蛋白质分子,而这些大于5000的生物分子只能够被排阻在由铰链葡聚糖颗粒之间的间隙中,,这种即用型Sephadex 重力脱盐柱也可以用于将含有大于5000的生物分子的缓冲溶液替换成另外一种所需要的缓冲溶液,这些铰链葡聚糖具有良好的色谱特性,硬度和流速.在有机溶剂,碱,弱酸,盐等溶液中具有良好的稳定性,能够被灭菌处理,甚至在中性溶液中120°C加热30分钟,也不会影响其色谱特性,整个实验过程不会超过1小时,在所用的缓冲溶液不会造成蛋白质与分离介质产生非特异性吸附的情况下,蛋白质的回收效率在90%以上. 贮存: 2～8℃
产品特性:总的柱体积10.0 ml;推荐的每次上样样品体积 0.25-0.3 ml;葡聚糖胶体积 2.5 ml ;葡聚糖胶颗粒间隙体积 (约~1/3胶体积 ) 0.9 ml;葡聚糖胶排阻极限 (相对于免疫球蛋白) 5,000 daltons ;葡聚糖胶颗粒直径 50-150 microns
编号        包装        价格        产地
BSP090        1 column        100        生工

Spin-OUT™ Column
离心式去盐柱       
Description:
The columns are spin format desalting columns that have the ability to remove: Salts Radioisotopes; Dyes; Primers; Deoxynucleotides (dNTPs); Buffer exchanges,The samples are added to the column and spun briefly to collect clean samples for further downstream processes. supplied in two sizes; the Micro size is for processing up to 200µl and the Medi size for processing up to 500µl.formulation: Spin-OUT™GT-600 is for the purification of proteins > 6kDa and nucleic acids larger than 10bp; Spin-OUT™GT-1200 is for the purification of proteins > 12kDa and nucleic acids larger than 20bp: Spin-OUT™PCR is for the cleaning of PCR products. Spin-OUT™PCR-20 removes contaminating products from PCR products, including <20bp primers, dNTPs and salts. Spin-OUT™ PCR-32 removes PCR products from <32bp primers, dNTPs and salts.Store: 18～25℃
Spin-OUT™ GT-1200, Medi       
编号        包装        价格        产地
786-173        10 columns        682        GBios
Spin-OUT™ PCR-32       
编号        包装        价格        产地
786-175        10 columns        715        GBios
Spin-OUT™ GT-1200, Micro       
编号        包装        价格        产地
786-172        10 columns        429        GBios
Spin-OUT™ GT-600, Micro       
编号        包装        价格        产地
786-170        10 columns        429        GBios
Spin-OUT™ PCR-20       
编号        包装        价格        产地
786-174        10 columns        473        GBios
Spin-OUT™ GT-600, Medi       
编号        包装        价格        产地
786-171        10 columns        682        GBios
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30楼2010-12-17 11:07:18
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Adam_Li

铜虫 (初入文坛)
sxxuan(金币+1): 2010-12-20 11:40:39
sxxuan(金币+1): 2010-12-20 11:44:50
这个蛋白理论上说可以直接冻干。如果你怕纯度有问题，想要脱盐的话，可以用超滤，如果小量就用超滤管离心，如果大量就用超滤膜包。至于冻干的话，有条件可以采用隔板加热，冻干速度快很多。
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31楼2010-12-18 17:19:50
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by Adam_Li at 2010-12-18 17:19:50:
这个蛋白理论上说可以直接冻干。如果你怕纯度有问题，想要脱盐的话，可以用超滤，如果小量就用超滤管离心，如果大量就用超滤膜包。至于冻干的话，有条件可以采用隔板加热，冻干速度快很多。

超滤膜包是不是那种像个烧杯似的东西？不太了解，请指教
估计以后都是要大量做的，谢谢
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32楼2010-12-20 11:41:53
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by AZURESKY1999 at 2010-12-17 10:13:18:

除盐的方式有很多，主要是根据目的蛋白的多少可以确定，但肯定的是多一个操作步骤，就多一些损失，特别是对于蛋白质量不多的来说，一定要慎重。如果蛋白量多，可以考虑G-25除盐，也可以考虑离子交换、包括阴离子 ...

嗯，现在在用疏水层析，希望可以把盐和杂蛋白都除去。
但一个很重要的问题就是，质粒污染太严重。就算用疏水层析还是去不掉质粒。也用DNA和RNA酶消化后再纯化的，还是不行，没辙了，救命啊
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33楼2010-12-20 11:44:37
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AZURESKY1999

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
Originally posted by sxxuan at 2010-12-20 11:44:37:

嗯，现在在用疏水层析，希望可以把盐和杂蛋白都除去。
但一个很重要的问题就是，质粒污染太严重。就算用疏水层析还是去不掉质粒。也用DNA和RNA酶消化后再纯化的，还是不行，没辙了，救命啊

那就要考虑疏水层析或离子交换，毕竟蛋白质和核酸在这两种交换柱上的吸附能力还是不一样的，一般来说，上样时核酸未经吸附就可以流出来，而蛋白质可以吸附在柱子上，但是要分别接收不同的出样峰跑电泳进行分析，以免造成失误
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34楼2010-12-23 16:40:52
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pch1967

铜虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
根据蛋白质百分比浓度加点保护剂（甘露醇或山梨醇，蔗糖等）
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36楼2012-12-15 05:01:12
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li1991511

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我感觉还是走一个S-100 除下盐 冻干 得加附形剂 不仅仅起附形作用 还起保护作用 一般都是甘露醇
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37楼2013-08-24 12:47:55
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bosh_shit

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
12楼: Originally posted by sxxuan at 2010-12-09 13:53:45
哎，做科研真痛苦...

在南农作科研更痛苦！
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38楼2014-11-18 14:50:02
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tingyusu

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by austin2008 at 2010-12-09 10:56:00
最好加点保护剂（2%的葡萄糖或山梨醇，蔗糖等），真空冷冻干燥，使液体表面积大点好，干燥的快些

2%是保护剂与酶液的比例吗？
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39楼2015-06-20 14:10:14
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hanweijuan35楼
2011-06-01 09:19   回复  
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