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101202139

铜虫 (小有名气)

[求助] 蛋白降解的问题

最近表达融合蛋白，然后将融合标签用酶切除，可是不知为什么酶切产物之一目的蛋白在跑SDS-PAGE后发现条带较弱，按道理的话，酶切一定量的融合蛋白，应该产生相同质量的融合标签和目的蛋白，再体积一致的情况下，浓度应该也是差不多的。我尝试将储存在零下20度一段时间的酶切产物重新跑SDS-PAGE，发现目的蛋白更弱了。不知为什么？望各位虫友不吝指教！
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1楼 2011-06-30 09:37:44
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

101202139

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by vcitor宇8 at 2013-04-08 13:38:08
你好，不知道你现在问题解决了吗？我目前也在做这个，酶切过后怎么把酶除去呢？谢谢...

我发现的问题是当时纯化目的蛋白，进行超声破碎的时候没有添加EDTA这种金属螯合剂，造成菌体内部的其它蛋白酶降解了我的目的蛋白。希望对你有帮助！
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10楼2013-04-08 18:13:30
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普通回帖

shuifen1108

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 2011-06-30 18:49:23
101202139(金币+2): 2011-06-30 21:37:37
切除融合标签所用的酶如Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶。这些酶可能会使目的蛋白其他部位发生断裂，或者是你在酶切后纯化目的蛋白的过程中出问题了
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2楼2011-06-30 13:28:01
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 2011-06-30 18:49:30
专一的酶不一定专一的，专一性是有条件的。另外污染微生物会产生蛋白酶导致降解的。
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3楼2011-06-30 13:58:06
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aayqaa

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 2011-06-30 18:49:36
蛋白在-20时降解还是挺厉害的，以前我也存-20后来存-80了
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4楼2011-06-30 17:42:10
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101202139

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by shuifen1108 at 2011-06-30 13:28:01:
切除融合标签所用的酶如Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶。这些酶可能会使目的蛋白其他部位发生断裂，或者是你在酶切后纯化目的蛋白的过程中出问题了

我用的内切酶是TEV酶，这种酶的专一性还是比较好的，目的蛋白上不会存在酶切位点。我是将纯化后的蛋白酶切后，跑SDS-PAGE，酶切产物还没有过柱子。
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5楼2011-06-30 21:35:50
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101202139

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-06-30 13:58:06:
专一的酶不一定专一的，专一性是有条件的。另外污染微生物会产生蛋白酶导致降解的。

TEV蛋白酶的专一性是有目共睹的，我的酶切缓冲液是经过高压灭菌的！
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6楼2011-06-30 21:42:58
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阿娇阿娇

新虫 (小有名气)
你好，看到你几个月前发的贴子，有问题想请教一下。我现在也想把纯化过的MBP融合蛋白进行Xa因子蛋白酶酶切，请问一下你是放在4度切的吗？酶切完在过柱子之前先跑个胶？切完怎么把蛋白酶给除去啊？  我最关心的是最后一个问题
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7楼2012-03-10 14:03:28
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lybio

金虫 (正式写手)
引用回帖:
1783459楼: Originally posted by lxj341401 at 2011-06-30 13:58:06:
专一的酶不一定专一的，专一性是有条件的。另外污染微生物会产生蛋白酶导致降解的。

请问专一性的条件指的是哪些
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8楼2012-04-25 15:35:24
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vcitor宇8

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 阿娇阿娇 at 2012-03-10 14:03:28
你好，看到你几个月前发的贴子，有问题想请教一下。我现在也想把纯化过的MBP融合蛋白进行Xa因子蛋白酶酶切，请问一下你是放在4度切的吗？酶切完在过柱子之前先跑个胶？切完怎么把蛋白酶给除去啊？  我最关心的是最后 ...

你好，不知道你现在问题解决了吗？我目前也在做这个，酶切过后怎么把酶除去呢？谢谢
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9楼2013-04-08 13:38:08
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