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菠萝蜜123

新虫 (小有名气)

[求助] 关于分光光度计测蛋白的问题 求助于大家

有几个问题想请教大家
我制备的昆虫血淋巴粗提液，没有加PMSF和苯基硫脲，用分光光度计测蛋白浓度，刚提完时测的是0.357，然后就把剩下的粗提液放在了4度冰箱里，过了几天再测（方法一样），吸光值变成了0.442，也就是里面蛋白增多了？这是怎么回事呢，是不是要放在-20°才可以？
还有一个  大家都说血缓要加PMSF和苯基硫脲，我买来的都是晶体，我直接往离心管里加然后再加血缓，可是，晶体还是晶体，根本不溶解啊，这样，PMSF和苯基硫脲能起到作用吗？
谢谢大家帮忙解答一下！
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1楼 2011-11-24 23:04:32
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
菠萝蜜123(金币+9): 2011-11-25 21:23:25
wanhscn(金币+3, MolEPI+1): Good！热心！专业！ 2011-11-25 21:33:26
兄弟你用药品从来不看是水溶性的还是溶于有机溶剂的么？

PMSF要溶于乙醇异丙醇等有机溶剂。

你的那个组织中会有蛋白酶不？裂解完后蛋白酶把你的蛋白全降解了。

试验都不提前设计的么？
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2011-11-25 18:00:13
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brightfuture01

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 辛苦！ 2011-11-28 10:52:45
我不太清楚你的组织破碎方法，要花很长时间么？
如果非要冻存的话就放液氮里面，至少放在-80.
不过为何不弄完一个就加loading buffer煮沸变性呢？然后完了一起跑电泳，这样也不怕降解了。
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8楼2011-11-25 22:29:34
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brightfuture01

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★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5): Good！连楼下一贴一起授予EPI！ 2011-11-28 10:54:25
引用回帖:
4楼: Originally posted by 菠萝蜜123 at 2011-11-25 21:35:32:
嗯  是的  这一块之前我就感觉非常模糊  首先我有个问题要请教  降解带来的后果是什么，后面我是用蛋白的粗提液来做SDS-PAGE，降解与否会带来不一样的结果吗？其次，我提的幼虫的血淋巴非常少，然后把它溶在缓冲 ...

你做SDS-PAGE的目的是什么？无非是想正确反映你组织里面蛋白的组成或者定位某蛋白的大小等原因，你的蛋白都降解了，那你跑这个电泳还有什么意义？PMSF是配成100mM的贮液，使用时的终浓度是1mM，所以体积应该也占不了多少，对实验没有什么明显影响。

PMSF在水中的半衰期是半个小时左右。为啥不是破完组织，测完浓度马上跑电泳呢？这些实验一上午都用不了应该就能就轻松做完了的。跑电泳的那点点样品应该还是有的吧？20ul 就足够了...
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6楼2011-11-25 21:52:34
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青豆同学

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励交流 2011-11-25 21:32:51
楼上说的很对，再就是，PMSF起作用也就是短时间的（我这里是用甲醇来溶的），几小时吧，毒性很大，通风橱里操作。还有就是，会不会是你样品不均匀呢？导致你测定误差？
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谢谢你给我信心与力量，我会努力！
3楼2011-11-25 21:05:09
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菠萝蜜123

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-11-25 18:00:13:
兄弟你用药品从来不看是水溶性的还是溶于有机溶剂的么？

PMSF要溶于乙醇异丙醇等有机溶剂。

你的那个组织中会有蛋白酶不？裂解完后蛋白酶把你的蛋白全降解了。

试验都不提前设计的么？

嗯  是的  这一块之前我就感觉非常模糊  首先我有个问题要请教  降解带来的后果是什么，后面我是用蛋白的粗提液来做SDS-PAGE，降解与否会带来不一样的结果吗？其次，我提的幼虫的血淋巴非常少，然后把它溶在缓冲液里，稀释的倍数是一定的，这样，问题来了，那我加入的带有PMSF的乙醇算不算稀释液呢？第三，PMSF那么快就降解完了，我要不停的加吗，因为试验关系，要保留一段时间才能做电泳。但是一直加也不现实啊！
谢谢解答
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4楼2011-11-25 21:35:32
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菠萝蜜123

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 青豆同学 at 2011-11-25 21:05:09:
楼上说的很对，再就是，PMSF起作用也就是短时间的（我这里是用甲醇来溶的），几小时吧，毒性很大，通风橱里操作。还有就是，会不会是你样品不均匀呢？导致你测定误差？

可是也不能在混匀器上混匀啊，因为怕由于振荡导致蛋白变性
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5楼2011-11-25 21:36:41
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菠萝蜜123

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-11-25 21:52:34:
你做SDS-PAGE的目的是什么？无非是想正确反映你组织里面蛋白的组成或者定位某蛋白的大小等原因，你的蛋白都降解了，那你跑这个电泳还有什么意义？PMSF是配成100mM的贮液，使用时的终浓度是1mM，所以体积应该也占 ...

嗯 之前也想过这种方法  但是我的样品 是从不同时间处理的材料上获得  也就是我要让一张胶上有不同处理时间所取得样品  那么必定不能一提取马上电泳啊   那这样 我每制备一个样品 把它冻存（也不放PMSF），用的时候再拿出来溶解 这样行吗？
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7楼2011-11-25 22:21:06
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菠萝蜜123

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-11-25 22:29:34:
我不太清楚你的组织破碎方法，要花很长时间么？
如果非要冻存的话就放液氮里面，至少放在-80.
不过为何不弄完一个就加loading buffer煮沸变性呢？然后完了一起跑电泳，这样也不怕降解了。

嗯  是个办法！但是煮沸完以后 过几天再跑不会对结果有什么影响吗？
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9楼2011-11-26 22:09:02
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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★
wanhscn(金币+1): 顶这句话！ 2011-11-27 16:07:35
引用回帖:
9楼: Originally posted by 菠萝蜜123 at 2011-11-26 22:09:02:
嗯  是个办法！但是煮沸完以后 过几天再跑不会对结果有什么影响吗？

无语了，为什么要过几天呢？如果你的样品很珍贵很少的话，不睡觉都得做完。
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10楼2011-11-26 22:38:35
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